通氣量對靈芝菌絲體液態深層發酵合成靈芝三萜的影響

馮 杰，馮 娜，楊 焱，劉 方，賈 薇，張勁松

國家食用菌工程技術研究中心農業部南方食用菌資源利用重點實驗室上海市農業遺傳育種重點實驗室 上海市農業科學院食用菌研究所，上海 201403

靈芝(Ganoderma lucidum)是擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝菌屬真菌，是中國傳統的藥用真菌，具有悠久的藥用歷史。靈芝的關鍵藥效成分是靈芝多糖和靈芝三萜［1］。靈芝三萜具有消炎止痛、鎮靜、解毒、保肝、抗艾滋病病毒、抗腫瘤、保肝作用，抑制組胺釋放、血管緊張素轉化酶等功能，是靈芝發揮藥效的重要物質基礎［2，3］。

作為靈芝類的主要化學成分之一，靈芝三萜類化合物吸引了越來越多研究者的關注?，F階段獲取靈芝三萜材料的方法有3 種，一是野外子實體或人工栽培的子實體，二是靈芝孢子，三是液體發酵菌絲體和發酵液。與人工栽培靈芝相比，通過液體深層發酵技術生產靈芝三萜具有菌絲增殖速度快，不受季節影響、生產周期短、三萜類含量相對穩定等特點，現成為獲取靈芝三萜的最有效方法［4，5］。盡管經過幾十年來的努力，液體發酵靈芝生產靈芝三萜已取得不少成果，但是到目前為止，靈芝三萜的產量仍然不能滿足其應用的需求。

近年來，靈芝液態深層發酵合成靈芝三萜的產量受到廣泛的關注，由于它們所具有的各種生理活性物質，目前更多的研究集中在其藥理應用［3］。很多研究集中在靈芝菌絲體搖瓶發酵的影響因素，如培養基配方優化、培養條件的選擇等方面［4，6，7］。但是靈芝菌絲體液態深層發酵的擴大培養目前還很少有報道。上海交通大學鐘建江等［4，7］對真菌靈芝發酵生產靈芝多糖和菌絲體中靈芝三萜酸作了較為深入的研究，涉及發酵培養基組成、環境因素的優化，發酵動力學研究及流加發酵，兩段法靜置培養等方面。他們在研究中發現，高的體積溶氧傳質系數對菌球形態有較大影響，或使培養物中大的菌球數目增多，或使菌球直徑相對增加，從而引發“氧限制”現象，而這卻有利于單位細胞靈芝酸的大量合成。因此選取發酵過程中的溶氧關鍵點加以控制或改變，可能會顯著改變原有發酵結果。

在擴大培養中影響靈芝三萜合成的因素很多，其中通氣量等影響較為顯著［5］。由于靈芝菌絲體在培養過程中粘度很大，對氧需求也很大［8-10］。因此為了滿足在培養過程中菌球能緊密生長，提高傳質系數，有必要對考慮靈芝液態深層發酵過程中的操作條件進行研究。基于以上分析，本研究采用5 L 攪拌式發酵罐研究靈芝菌絲體液態深層發酵合成靈芝三萜的擴大培養條件，考察了4 種條件下的通氣量對靈芝菌絲體生長、靈芝三萜合成、還原糖消耗、以及銨根離子消耗的影響。以期得出較佳的操作條件，為靈芝菌絲體的工業放大生產提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試菌株滬農靈芝1 號由中國微生物菌種保藏管理委員會農業微生物中心上海食用菌分中心提供，菌株編號:Ganoderma lucidum G0119。

1.2 培養基

斜面培養基(g/L):去皮馬鈴薯200 g，加1000 mL 蒸餾水煮沸后，過濾，加入葡萄糖20 g，瓊脂25 g，補加蒸餾水至1000 mL，121 ℃滅菌25 min 后備用。

種子培養基(g/L):去皮馬鈴薯200 g，加1000 mL 蒸餾水煮沸后，過濾，加入20 g 葡萄糖，補加蒸餾水至1000 mL，攪拌均勻，121 ℃滅菌25 min 后備用。

發酵培養基(g/L):葡萄糖30，氯化銨3.5，七水硫酸鎂2，磷酸二氫鉀2，調節pH 至5.50，121 ℃滅菌25 min 后備用。發酵培養基中葡萄糖，七水硫酸鎂和磷酸二氫鉀組成由前期研究獲得，請見參考文獻［11］。其中氯化銨濃度根據優化結果確定其濃度為3.5 g/L。

1.3 主要設備

發酵罐:上海保興生物設備工程有限公司BIOTECH-5BGZ-50JS 5 L 發酵罐。

酶標儀:美國Bio-Tek 公司BioTek-Synergy HT多功能酶標儀。

1.4 培養條件

菌種活化:挑取冷凍管保藏菌種于斜面培養基中，26 ℃恒溫箱倒置培養15 d 后置于4 ℃冰箱待用和保藏。

種子培養:將已活化的斜面菌種接種于裝有100 mL 液體種子培養液的250 mL 三角瓶中，在150 rpm，26 ℃條件下搖床培養10 d，制得種子液。

發酵罐培養:將制備好的種子液轉接至5 L 發酵罐中進行培養。其中，接種量10%，發酵罐裝液量4 L，攪拌轉速100 rpm，培養溫度26 ℃［11］，通氣量分別4，6，8，10 L/min，培養至還原糖和銨根離子濃度無明顯變化結束發酵。

1.5 分析方法

菌體濃度的測定:取發酵液100 mL 在10000 rpm 下離心10 min 棄上清液，后取沉淀用去離子水洗滌3 次，收集后放在60 ℃的烘箱中烘干至恒重，精確稱重。

還原糖含量的測定:取適當稀釋倍數的發酵上清液，采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖濃度［12］。

銨根離子含量的測定:取適當稀釋倍數的發酵上清液，采用水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法測定氯化銨中銨根離子濃度［13］。

靈芝三萜含量的測定:齊墩果酸比色法［14］。

1.6 動力學參數的計算

不同通氣量條件下菌絲體比生長速率，還原糖和銨根離子比消耗速率，靈芝三萜比合成速率根據參考文獻［15］計算得出。用Origin 8.5 軟件對實驗數據進行插值計算并求解出不同通氣量條件下的比速率值。

1.7 數據處理

試驗數據采用Origin 8.5 軟件和SPSS 20.0 數據處理軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 通氣量對靈芝液態深層發酵過程中菌絲體生長的影響

通氣量對靈芝菌絲體生長、產物合成及代謝的影響是多方面的，不僅可以改變菌絲體對溶解氧攝取的環境，而且會影響菌絲體代謝過程中各種關鍵酶的活性。通氣量對菌絲體液態發酵的影響是各種因素綜合表現的結果，因此在菌絲體液態發酵過程中必須保證穩定而合適的溶氧環境，即穩定和合適的通氣量。

如圖1 所示的在不同通氣量條件下，靈芝菌絲體的生長變化情況。由圖1 分析可知，從4 L/min通氣量到10 L/min，靈芝菌絲體干重呈現規律性變化。在4 L/min 和6 L/min 通氣量條件下，菌絲體生長的遲滯期約在0 h 到100 h 之間，在100 h 后進入對數期，在200 h 前后進入穩定期，達到最大菌絲體含量。而在8 L/min 和10 L/min 條件下，菌絲體的遲滯期相對較短，在48 h 前后即進入對數期，約在100 h 前后進入穩定期。在8 L/min 通氣量條件下，最大菌絲體干重為8.77 g/L，比4L/min、6 L/min 和10 L/min 通氣量條件下分別提高44.48%、34.51%和15.09%。

再如圖1 所示在不同通氣量條件下，靈芝菌絲體的比生長速率也呈現規律性變化。比生長速率是指每小時單位質量的菌絲體所增加的菌絲體量稱為菌絲體比生長速率。它是表征微生物生長速率的一個參數，也是發酵動力學中的一個重要參數。比生長速率值越大，表明菌絲體的生長活力越大。在4 L/min 至10 L/min 通氣量范圍內，在8 L/min 條件下菌絲體最早達到最大比生長速率，依次分別為10 L/min，4 L/min 和6 L/min 條件。分析原因可能是靈芝菌絲體作為好氧真菌的典型代表，其生長過程與溶解氧濃度密不可分，在適當范圍內，溶解氧濃度越大，即通氣量越大，越有利于菌絲體的生長。且較高的溶解氧濃度促使菌絲體的生長代謝加快，較早進入對數生長期，其比生長速率也是較早達到最大值。

圖1 不同通氣量下菌絲體生長和比生長速率的變化情況Fig.1 Time curves of mycelial growth and specific mycelial growth rate under different aeration rates

2.2 通氣量對靈芝液態深層發酵過程中還原糖含量的影響

不同通氣量對菌絲體消耗還原糖有較大差別的影響。由圖2 分析可知，隨著菌絲體的快速生長，還原糖的消耗也逐漸加快，通氣量越大消耗還原糖的速率也越快，這與菌絲體的生長趨勢是保持一致的。在8 L/min 條件下，還原糖消耗速率最快，還原糖的最終濃度為7.5 g/L，利用率為74.98%，相比較于其他條件下的利用率分別提高了56.24%、46.28%和23.92%。通氣量加大，發酵液中還原糖消耗的更為徹底，與靈芝菌絲體的增加相對應。

不同通氣量條件下還原糖的比消耗速率變化也很明顯。比消耗速率指的是單位時間內單位菌體消耗基質的量。比消耗速率反應的是菌絲體對底物利用快慢的物理量。由圖2 分析可知，在較為適中的通氣量8 L/min 的條件下，發酵液中還原糖的比消耗速率最大，與之對應的比生長速率也最快。在不同通氣量條件下最大還原糖比消耗速率分別為0.0679 1/h、0.0714 1/h、0.562 1/h 和0.176 1/h。在8 L/min 條件下，還原糖比消耗速率也較早達到最大值，對于菌絲體生長和靈芝三萜的合成是有利的。同時，在8 L/min 條件下，發酵后期發酵液中的溶氧仍然保持較高的濃度，因此在較大的通氣量下， 靈芝菌絲體生長較為充分。

圖2 不同通氣量下還原糖含量和還原糖比消耗速率的變化情況Fig.2 Time curves of reducing sugar consumption and specific reducing sugar consumption rate under different aeration rates

2.3 通氣量對靈芝液態深層發酵過程中銨根離子含量的影響

由圖3 可見，發酵液中初始氯化銨的理論濃度為3.5 g/L，即銨根離子理論濃度為1.18 g/L。進入對數生長期的靈芝菌絲體迅速分解氮源，吸收營養物質，致使銨根離子濃度迅速下降，在4 L/min 和6 L/min 通氣量條件下，發酵至240 h 銨根離子濃度保持穩定，直至發酵結束整個體系中銨根離子含量始終保持在較高的水平。在8 L/min 和10 L/min通氣量條件下，發酵至156 h 銨根離子濃度保持穩定，直至發酵結束整個體系中銨根離子含量始終保持在較低的水平，尤其在8 L/min 通氣量條件下，最終銨根離子的含量達到0.22 g/L，為所有條件下最低。

再由圖3 分析可知，隨著菌絲體的快速生長，銨根離子的消耗也逐漸加快，通氣量越大消耗銨根離子的速率也越快，這與菌絲體的生長趨勢是保持一致的。在較為適中的通氣量8 L/min 的條件下，發酵液中銨根離子的比消耗速率最大，與之對應的比生長速率也最快。在不同通氣量條件下最大銨根離子比消耗速率分別為0.00293 1/h、0.00390 1/h、0.0171 1/h 和0.00185 1/h。在8 L/min 條件下，銨根離子比消耗速率也較早達到最大值，對于菌絲體生長和靈芝三萜的合成也是有利的。

圖3 不同通氣量下銨根離子含量和銨根離子比消耗速率的變化情況Fig.3 Time curves of ammonium consumption and specific ammonium consumption rate under different aeration rates

2.4 通氣量對靈芝液態深層發酵過程中靈芝三萜合成的影響

由圖1 和圖4 可見，液態深層發酵過程中靈芝三萜的積累與菌絲體的生長屬于部分生長偶聯型。在菌絲體處于對數生長期時，靈芝三萜合成速率較慢;當菌絲體生長進入穩定期時，菌絲體干重的增長趨勢減慢，菌絲體濃度保持在一個較穩定的水平，而靈芝三萜的合成速率卻有明顯的提高。由圖4 可知，通氣量在4 L/min 至10 L/min 之間，隨著通氣量的提高靈芝三萜得率也在不斷增加，通氣量為8 L/min 時，靈芝三萜得率最大，達到2.33 mg/100 mg菌絲體，比4 L/min、6 L/min 和10 L/min 通氣量條件下的靈芝三萜得率分別提高了1.39 倍、0.99 倍和0.84 倍，達到最大比合成速率0.0256 1/h 時，所用的時間最短，為70 h。由此可見，高通氣量對于菌絲體生長和靈芝三萜的合成都有明顯的促進作用。

再由圖4 可以得出，通氣量在4 L/min 至10 L/min 之間，達到最大比合成速率的時間分別為118、81、70、108 h，當通氣量為8 L/min 時，比合成速率的增幅最大，且達到最大比合成速率的時間最短，而合成靈芝三萜的時間相對其他通氣量條件也是最短的。綜合比較靈芝三萜得率、比合成速率以及發酵周期情況，通氣量在4 L/min 至10 L/min 內，8 L/min 為最佳通氣量。

圖4 不同通氣量下靈芝三萜合成和比合成速率的變化情況Fig.4 Time curves of triterpenes production and specific triterpenes production rate under different aeration rates

2.5 通氣量條件下各動力學參數變化的比較

將圖1、圖2、圖3 和圖4 中實驗數據進行整理，得到不同通氣量條件下靈芝菌絲體液態深層發酵過程參數，如表1 所示。在整個發酵過程中，通氣量對不同參數的影響是有差異的，甚至是相反的。其中，菌絲體平均比生長速率和靈芝三萜平均比合成速率在8 L/min 條件下達到最大值，分別為18.75 ×10-31/h 和7.02 ×10-31/h，而最大菌絲體干重，靈芝三萜得率，菌絲體生產強度和靈芝三萜生產強度也是在同一條件下達到最高值。由此可見，菌絲體生長和靈芝三萜的合成是同步的。因此，在菌絲體液態深層發酵過程中在適當的通氣量范圍內，高的通氣量利于菌絲體的生長和靈芝三萜的合成。

表1 不同通氣量條件下的靈芝菌絲體發酵參數比較Table 1 Fermentation parameters in different agitation rates

注:生產強度定義為單位時間單位體積的菌絲體或靈芝三萜的生產量，單位g/(L·h)。Note:Productivity was defined as the producing amount per one litre and one hour，the unit was g/(L·h).

3 結論

在靈芝菌絲體培養過程中，溶氧濃度是一個非常關鍵的控制參數，氧的適度供給是保證菌絲體良好生長和代謝產物高產的必要條件，特別是對絲狀真菌發酵的影響尤為明顯，其中通氣量對發酵液的溶氧濃度起到直接的作用。

通氣量在靈芝菌絲體發酵過程中主要起著混合和調節溶氧的作用，影響著菌絲球的大小，包括影響菌絲纏繞成球或打碎菌絲球，發酵過程中通氣量作用對菌絲球尺寸的影響，間接地影響菌球內氧及底物的消耗，同時對靈芝三萜的合成都有直接的影響，但是由于靈芝菌絲體對通氣量敏感，過高或過低的通氣量使菌絲體量、菌體形態以及靈芝三萜的合成發生一定的變化。

本實驗通過考察通氣量對靈芝菌絲體液態發酵過程中合成靈芝三萜的影響，研究發現，通氣量在4 L/min 至10 L/min 之間，8 L/min 為最優通氣量。在此條件下，靈芝三萜的生產強度最大，達到0.00131 g/(L·h)，靈芝三萜得率最大，達到0.204 g/L，菌絲體的最大菌濃達到8.77 g/L，實現了液態深層發酵靈芝三萜的高產量、高產率和高生產強度的統一。同時菌絲體對碳源(葡萄糖)和氮源(氯化銨)的利用率也最高，分別為74.97%和78.22%，對底物較高的利用率促進了菌絲體生長和靈芝三萜的合成。過高或者過低的通氣量對菌絲體的生長，對底物的利用和對靈芝三萜的合成均不利。通過研究通氣量對靈芝菌絲體液態發酵過程中合成靈芝三萜的影響，確定出較佳的通氣量條件，可以為后續的研究提供基礎，同時為生產的擴大化提供更好的參考。

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