稻綠核菌胞外多糖抗氧化活性和培養(yǎng)基優(yōu)化

呂仕瓊，于瑞婷，董雪嬌，林鋒科，徐 丹，岳 陽，賴道萬，周立剛

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193

稻曲病(Rice false smut)是危害水稻穗部的真菌病害，其病原為稻綠核菌(有性態(tài):Villosiclava virens;無性態(tài):Ustilaginoidea virens)，稻曲病會(huì)嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)［1，2］。稻綠核菌能產(chǎn)生稻曲菌素(Ustiloxins)和稻綠核菌素(Ustilaginoidins)等次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性和應(yīng)用開發(fā)潛力。稻曲菌素為環(huán)肽類化合物，主要表現(xiàn)為細(xì)胞毒和抗腫瘤活性［3-5］。稻綠核菌素為二萘并-γ-吡喃酮類化合物(Bis-naphtho-γ-pyrones)，具有細(xì)胞毒活性［6］、抗菌活性［7，8］、HIV 整合酶抑制活性［9］等。

在大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)稻綠核菌UV-2 制備稻曲菌素和稻綠核菌素的同時(shí)，本研究對該真菌產(chǎn)生的多糖及其抗氧化活性進(jìn)行了研究，制備得到菌絲水提多糖(WPS)、菌絲堿提多糖(SPS)和胞外多糖(EPS)，其中胞外多糖具有較好的抗氧化活性。進(jìn)一步對生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，有效提高了胞外多糖的得率，為將來大規(guī)模培養(yǎng)稻綠核菌生產(chǎn)活性物質(zhì)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

稻綠核菌(Vilosiclava virens)UV-2 菌株(下同)為稻曲病病原，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所陳志誼研究員提供。稻綠核菌于4 ℃下保存在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上。

1.2 儀器與試劑

Power Wave HT 多孔板分光光度計(jì)(美國BioTek 公司)、TU-1810 分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、FreeZone 冰凍干燥機(jī)(美國Labconco 公司)、DELTA-320 型pH 計(jì)(Mettler Toledo 儀器上海有限公司)、LS-B55L 型立式壓力蒸汽滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療儀器廠)、FLC-3 型超凈工作臺(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)、AL-104 型電子分析天平(Mettler Toledo 儀器上海有限公司)、DRP-9162 型恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、TS-8 型轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、RE50 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)等。所用試劑均為分析純。

1.3 多糖的制備

1.3.1 稻綠核菌的發(fā)酵培養(yǎng)

從保種管中挑起少許菌絲接種到PDA 平板上活化10 d 左右，挑取活化的菌絲接種于250 mL 的三角瓶中，每瓶裝100 mL 馬鈴薯-葡萄糖(PD)培養(yǎng)液，于28 ℃，150 rpm 搖培7 d 左右，作為種子培養(yǎng)液備用。

每1 L 稻綠核菌的發(fā)酵培養(yǎng)液中含:葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.2、K2HPO40.6、NaCl 0.6 g，初始pH 值為7.0。250 mL 三角瓶中裝發(fā)酵培養(yǎng)液100 mL，接種10 個(gè)大小一致的菌絲球。于28 ℃、150 rpm 暗培養(yǎng)25 d后收獲，共200 瓶，發(fā)酵液總體積20 L。收獲的發(fā)酵液經(jīng)抽濾，獲得菌絲和菌液。經(jīng)冰凍干燥后的菌絲(203.9 g)用于提取菌絲水提多糖(WPS)和堿提多糖(SPS)。菌液(20 L)濃縮至1 L，用于制備胞外多糖(EPS)。

1.3.2 稻綠核菌菌絲水提多糖的制備

真菌菌絲水提多糖(WPS)的制備參考Li 等的方法［10］。具體步驟如下:將凍干的稻綠核菌菌絲研碎，經(jīng)脫脂后，晾干，稱取一定量(100 g)，添加蒸餾水，水料比約為30∶1(v/w)，置于熱回流提取器內(nèi)，90 ℃條件下提取3 次，每次2 h。離心后殘?jiān)糜诰z堿提多糖的提取，上清液合并，減壓濃縮到小體積，向濃縮的提取液中加入3 倍體積的無水乙醇，4℃醇沉48 h。離心(17418 g)15 min 后，去除上清液，用乙醇和丙酮反復(fù)洗滌沉淀，得菌絲水提粗多糖，再經(jīng)脫脂、脫蛋白、脫色和透析處理，最終收集透析袋中的溶液，經(jīng)濃縮、冰凍干燥，獲得稻綠核菌UV-2 菌絲水提多糖(0.26 g)。

1.3.3 稻綠核菌菌絲堿提多糖的制備

真菌菌絲堿提多糖(SPS)的制備參考Li 等的方法［10］，具體步驟如下:將上述已提取菌絲水提多糖的菌絲殘?jiān)?約100 g)，在1 M 的NaOH 溶液中室溫浸提24 h。離心去除殘?jiān)占锨逡海瑴p壓濃縮到小體積，向濃縮得提取液中加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃醇沉48 h。離心(17418 g)15 min 后，去除上清液，用乙醇和丙酮反復(fù)洗滌沉淀，得菌絲堿提粗多糖，再經(jīng)脫脂、脫蛋白、脫色和透析處理，最終收集透析袋中的溶液，經(jīng)濃縮、冰凍干燥，獲得稻綠核菌UV-2 菌絲堿提多糖(0.31 g)。

1.3.4 稻綠核菌胞外多糖的制備

真菌胞外多糖(EPS)的制備參考Li 等的方法［11］，具體步驟如下:向濃縮的菌液中加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃醇沉48 h。離心(17418 g)15 min 后，去除上清液，用乙醇和丙酮反復(fù)洗滌沉淀，得胞外粗多糖，再經(jīng)脫脂、脫蛋白、脫色和透析處理，最終收集透析袋中的溶液，經(jīng)濃縮、冰凍干燥，獲得稻綠核菌UV-2 胞外多糖(5.48 g)。

1.4 多糖含量的測定

采用蒽酮-硫酸法測定糖含量［12］。首先配制濃度為1.0 mg/mL 的葡萄糖母液，稀釋至系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度范圍為0.02～0.12 mg/mL。然后，吸取2 mL 葡萄糖溶液于試管中，置于冰浴中，隨即添加5 mL 濃度為0.2%的蒽酮-硫酸溶液，迅速搖勻。在沸水浴中反應(yīng)15 min 后，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中終止反應(yīng)，室溫靜置15 min。用分光光度計(jì)在最大吸收波長620 nm 下測定各個(gè)反應(yīng)液吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=5.4143X+0.0982 (R2=0.9949):Y為620 nm 下的吸光值，X 為實(shí)際反應(yīng)的葡萄糖量(mg)。稱取一定量的多糖樣品(EPS、WPS、SPS)，配制成適當(dāng)濃度的溶液，實(shí)驗(yàn)步驟同于標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖。通過測定620 nm 下的吸光值，即可計(jì)算出糖含量。

1.5 多糖抗氧化活性的測定

1.5.1 Fe3+還原能力的測定

參考Fan 等方法［13］。首先，配制以下4 種溶液備用:濃度為0.2 M pH 6.6 的磷酸緩沖溶液100 mL;濃度均為1%的鐵氰化鉀水溶液和三氯化鐵水溶液各50 mL;濃度為10%的三氯乙酸溶液50 mL。接著，配制系列梯度濃度樣品溶液，陽性對照為2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(Butylated hydroxytoluene，BHT)。Fe3+還原能力的測定步驟如下:向96 微孔板中依次加入50 μL 樣品溶液，20 μL 1%的鐵氰化鉀和30 μL 磷酸緩沖溶液，振蕩混勻，在50 ℃下反應(yīng)20 min。待冷卻至室溫，反應(yīng)孔中再加入70 μL 10%的三氯乙酸溶液和10 μL 1%三氯化鐵溶液。振蕩混勻，室溫反應(yīng)10 min。測定其在700 nm 下的吸光值。

1.5.2 羥基自由基(·OH)清除能力測定

參考Thirunavukkarasu 等方法［14］。配制濃度2 mg/mL 的FeSO4·7H2O 100 mL;1.5 mg/mL 的水楊酸(Salicylic acid)溶液150 mL;配制1%的H2O2溶液;配制系列梯度濃度樣品溶液，以抗壞血酸(Ascorbic acid，AA)作為陽性對照，乙醇作為陰性對照。反應(yīng)體系如下:首先，向微孔板中依次加入25 μL 2 mg/mL 的FeSO4·7H2O 溶液，50 μL 1%的H2O2溶液，50 μL 1.5 mg/mL 的水楊酸溶液和50 μL 樣品溶液，振蕩混勻，37 ℃反應(yīng)1 h。然后用微孔板分光光度計(jì)測定其在525 nm 下的吸光值。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

D0:添加50 μL 蒸餾水代替樣品液反應(yīng)體系的吸光值;D1:添加50 μL 樣品液反應(yīng)體系的吸光值;D2:50 μL 乙醇代替50 μL 水楊酸溶液時(shí)反應(yīng)體系的吸光值。

建立以供試樣品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，·OH 清除率(%)為縱坐標(biāo)(Y)的線性回歸方程Y=aX+b，以此求得樣品·OH 清除能力的有效中濃度EC50。

1.6 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)

采用Plackett-Burman(P-B)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基組成［15］，生產(chǎn)稻綠核菌胞外多糖(EPS)。發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖、蛋白胨、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4、NaCl、pH 調(diào)至7.0。胞外多糖的制備過程同1.3.4，糖含量的測定同1.4。以稻綠核菌胞外多糖的得率(mg/L)作為唯一檢測指標(biāo)。胞外多糖得率(mg/L)=EPS 干重(g/L)× EPS 糖含量(%)。使用Expert-Design 8.0 軟件，選用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選主效因子。本研究設(shè)計(jì)了7 個(gè)因子，共進(jìn)行12 組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次。表1 中為PB 實(shí)驗(yàn)中研究的7 個(gè)變量及其水平。按照Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)配制各種培養(yǎng)基，分裝于250 mL 三角瓶中，每瓶裝入100 mL 相應(yīng)配比的培養(yǎng)液，高壓蒸汽滅菌15 min，待其冷卻后接種。種子培養(yǎng)基及接種量及其培養(yǎng)條件如1.3.1 所示。收獲后，制備稻綠核菌EPS，計(jì)算其得率。

表1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)中的變量及其水平Table 1 Levels and values of the variables tested in Plackett-Burman design

1.7 單因素實(shí)驗(yàn)

葡萄糖單因素實(shí)驗(yàn):研究了葡萄糖分別為40、50、60、70、80 和90 g/L，蛋白胨為10 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 為0.05 g/L，MgSO4·7H2O 為0.2 g/L，K2HPO4為0.6 g/L，NaCl 為0.6 g/L，初始pH 調(diào)至7.0 條件下稻綠核菌EPS 的得率。從而確定中心組合設(shè)計(jì)(CCD)中主效因子葡萄糖的取值范圍。

蛋白胨單因素實(shí)驗(yàn):研究了蛋白胨分別為5、10、15、20、25 和30 g/L，葡萄糖為50 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 設(shè)為0.05 g/L，MgSO4·7H2O 為0.2 g/L，K2HPO4為0.6 g/L，NaCl 為0.6 g/L，初始pH 調(diào)至7.0 條件下稻綠核菌EPS 的得率。從而確定CCD中主效因子蛋白胨的取值范圍。

1.8 中心組合實(shí)驗(yàn)

通過P-B 實(shí)驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)，篩選出了稻綠核菌發(fā)酵培養(yǎng)基的主效成分葡萄糖和蛋白胨及其取值范圍。在此基礎(chǔ)上利用Expert Design 8.0 軟件進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)(Central composite design，CCD)。CCD 實(shí)驗(yàn)中的變量及其水平見表2。

本研究中，采用二因素五水平CCD 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，共設(shè)計(jì)13 組實(shí)驗(yàn)，各變量及其取值范圍見表7。以X1，X2分別代表葡萄糖和蛋白胨的實(shí)際取值，x1、x2代表對應(yīng)的編碼值。X 與x 之間用以下關(guān)系式表示:xi=(Xi-X0)/ △X，i=1、2，xi為Xi的編碼值，X0為Xi的中心點(diǎn)，△X 變量X 取值步長。利用Expert Design 8.0 軟件可以建立EPS 得率為因變量，葡萄糖和蛋白胨為自變量的二次多項(xiàng)式回歸模型，可用如下公式表示:

其中，Y 為目標(biāo)響應(yīng)預(yù)測值，a0為常數(shù)項(xiàng)，x1和x2為自變量;a1和a2為線性相關(guān)系數(shù)，a3為交互作用相關(guān)系數(shù)，a4和a5為平方相關(guān)系數(shù)。

表2 中心組合設(shè)計(jì)中的變量及其水平Table 2 Values of the variables tested in CCD and their levels

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有的處理均設(shè)置三個(gè)重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并通過SAS version 8.2 軟件進(jìn)行顯著性差異分析，當(dāng)P ≤0.05 時(shí)，表明各處理間差異達(dá)到顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的制備

通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)獲得稻綠核菌發(fā)酵液，經(jīng)抽濾，得菌絲和菌液，菌絲經(jīng)冰凍干燥得203.9 g 干重，將凍干的菌絲粉碎，用于菌絲水提多糖(WPS)和堿提多糖(SPS)的制備。菌液(20 L)用于胞外多糖(EPS)的制備。多糖制備結(jié)果見表3。

表3 稻綠核菌多糖的制備Table 3 Preparation of the polysaccharides from V.virens

2.2 多糖的抗氧化活性

一般采用清除自由基的效率和還原能力的大小為檢測指標(biāo)，從離體或整體水平上衡量多糖抗氧化作用的強(qiáng)弱［16］。本研究對多糖的Fe3+的還原能力和羥基自由基(·OH)清除能力進(jìn)行了檢測。3 種多糖(WPS、SPS、EPS)對Fe3+還原能力和·OH 清除能力分別見圖1 和表4。如果多糖對Fe3+還原能力越強(qiáng)，反應(yīng)液在700 nm 處的吸收值就越大，3 種多糖中，胞外多糖(EPS)對Fe3+的還原能力最強(qiáng)，其次是菌絲堿提多糖(SPS)，菌絲水提多糖(WPS)對Fe3+的還原能力最弱(圖1)。

圖1 稻綠核菌多糖對Fe3+的還原能力Fig.1 Fe3+ reducing activity of the polysaccharides from V.virens

EPS 對·OH 表現(xiàn)出較好的清除能力，其EC50值為169.2 μg/mL，優(yōu)于陽性對照抗壞血酸(EC50值為705.5 μg/mL)。SPS 未檢測出對·OH 的清除能力(表4)。

表4 稻綠核菌多糖清除·OH 自由基的有效中濃度Table 4 Median effective concentration (EC50)of the polysaccharides from V.virens for scavenging ·OH radical.

2.3 生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基主效因子的篩選

為了有效提高稻綠核菌UV-2 胞外多糖(EPS)的得率，根據(jù)基本培養(yǎng)基組分(葡萄糖、蛋白胨、硫酸亞鐵、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉)，通過Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，篩選出培養(yǎng)基中影響EPS 生產(chǎn)的主效因子。運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表5)。按該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配制相應(yīng)的培養(yǎng)基用于稻綠核菌UV-2 的發(fā)酵培養(yǎng)，得到每種培養(yǎng)基中的EPS得率(mg/L)。對實(shí)驗(yàn)所得響應(yīng)值進(jìn)行方差分析(表6)，被篩選的7 個(gè)因子中，葡萄糖和蛋白胨對稻綠核菌UV-2 的EPS 得率有著較為顯著的影響(P＜0.05)，其它5 個(gè)因子(硫酸亞鐵、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉)對EPS 產(chǎn)率的影響不明顯。因此，葡萄糖和蛋白胨作為主效因子用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步篩選出主效因子(葡萄糖和蛋白胨)在中心組合設(shè)計(jì)(CCD)中的中心點(diǎn)及相應(yīng)取值范圍，針對葡萄糖和蛋白胨設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，以實(shí)現(xiàn)EPS 得率的最大化。

如圖2A 所示，隨著葡萄糖濃度的增加，EPS 的得率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)葡萄糖的濃度由40 g/L 梯度增加到80 g/L 時(shí)，EPS 的得率呈迅速上升趨勢。當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到80 g/L 的時(shí)候，EPS 的得率達(dá)到最大值(748.00 mg/L)，隨著濃度進(jìn)一步增加，EPS 的得率有所下降，但仍處于較高的水平。因此，將葡萄糖的濃度設(shè)定在70～90 g/L 范圍內(nèi)，較有利于稻綠核菌UV-2 胞外多糖的分泌。由此設(shè)定CCD 實(shí)驗(yàn)中葡萄糖濃度在中心點(diǎn)水平為80 g/L，“-1”水平和“+1”水平分別為70 g/L 和90 g/L。

表5 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Plackett-Burman experimental matrix and the results

表6 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選結(jié)果的顯著性分析Table 6 Analysis of variance (ANOVA)for responses from the Plackett-Burman screening test

如圖2B 所示，隨著蛋白胨濃度的增加，EPS 的得率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)?shù)鞍纂说臐舛扔? g/L 梯度增加到15 g/L 時(shí)，EPS 的得率呈迅速上升趨勢。當(dāng)?shù)鞍纂藵舛冗_(dá)到15 g/L 的時(shí)候，EPS 的得率達(dá)到最大值(553.00 mg/L)，隨著濃度進(jìn)一步增加，EPS 的得率反而有所下降，但還是處于較高的水平。因此將蛋白胨的濃度設(shè)定在10～20 g/L 范圍，較有利于稻綠核菌UV-2 胞外多糖的分泌。由此設(shè)定CCD 實(shí)驗(yàn)中蛋白胨濃度在中心點(diǎn)為15 g/L，“-1”水平和“+1”水平分別為10 g/L 和20 g/L。

圖2 單因素實(shí)驗(yàn)中葡萄糖(A)和蛋白胨(B)對稻綠核菌胞外多糖得率的影響Fig.2 Effects of glucose (A)and peptone (B)on EPS yield of V.virens in the single-factor experiments

2.3.3 中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件分析CCD 實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)(如表7 所示)，建立EPS 得率與葡萄糖、蛋白胨之間的二次多項(xiàng)回歸模型。運(yùn)用該模型可以預(yù)測在這兩個(gè)變量取值范圍內(nèi)任意一點(diǎn)所對應(yīng)的EPS 得率。

用編碼值建立的二次多項(xiàng)式回歸模型如下:

其中Y 為EPS 的得率，x1、x2為葡萄糖(X1)和蛋白胨(X2)相對應(yīng)的編碼值。

將編碼值轉(zhuǎn)換成實(shí)際值建立的二次多項(xiàng)式回歸模型如下:

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 對該二次多項(xiàng)式進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表8 所示。采用Fisher’s F 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該模型具有較高的F 值(45.91)和極低的P值(＜0.0001)，說明所建立的模型顯著。該模型的決定系數(shù)(R2)和校正系數(shù)adj-R2近1，說明該模型的相關(guān)關(guān)系極顯著。該模型的失擬估計(jì)Lack of fit經(jīng)F 分別為0.9735 和0.9434，相對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)R和adj-R 分別為0.9851 和0.9743，經(jīng)檢驗(yàn)，F(xiàn) 值較低，為5.09，p＞F 的概率為0.0752(＞0.05)，說明失擬估計(jì)不顯著。此外，該模型的變異系數(shù)CV(%)僅為7.11。綜上所述，較高的相關(guān)系數(shù)，不顯著的Lack of fit，以及較低的CV (%)值說明所建立的二次多項(xiàng)回歸模型合理可靠。比對CCD 實(shí)驗(yàn)中該模型的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值(如表7 所示)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者之間不存在顯著差異，證明該模型具有較好的擬合度。

表7 CCD 實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果Table 7 CCD experimental matrix and the results

表8 二次多項(xiàng)式模型的方差分析結(jié)果Table 8 Analysis of variance (ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

對該二次多項(xiàng)模型的二次項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果如表9 所示。采用F 檢驗(yàn)，所得結(jié)果F 值越大，p 值越小，則該二次項(xiàng)對Y 值的影響越顯著。分析結(jié)果表明，除二次項(xiàng)“x1x2”(即葡萄糖與蛋白胨之間的交互作用)外，其余二次項(xiàng)對EPS 的得率均具有顯著作用。

2.3.4 響應(yīng)面分析

圖3 為稻綠核菌胞外多糖EPS 得率隨著變量葡萄糖和蛋白胨濃度的變化而變化的3D 響應(yīng)面圖和與之相對應(yīng)的2D 等高線圖。從圖3 中可以看出，葡萄糖和蛋白胨的濃度以及二者之間的交互作用對EPS 得率具有顯著的影響。EPS 的得率隨著葡萄糖和蛋白胨濃度的增加均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但葡萄糖和蛋白胨兩者之間的交互作用對EPS 的得率影響不顯著，這一點(diǎn)可以通過2D 等高線圖(圖3B)中心呈較規(guī)則的圓形得以推出。3D 響應(yīng)面圖(圖3A)的最高點(diǎn)即為EPS 得率的最大值點(diǎn)，該點(diǎn)投射到其正下方時(shí)位于中心等高線內(nèi)，即2D 中心等高線范圍內(nèi)的區(qū)域。由此，可以推測出EPS 得率最大時(shí)葡萄糖和蛋白胨濃度取值范圍分別為82.5～86.2 g/L 和13.5～15.0 g/L。

2.3.5 稻綠核菌產(chǎn)胞外多糖最佳培養(yǎng)條件的驗(yàn)證

根據(jù)已經(jīng)建立的二次多項(xiàng)式回歸模型Y=855.20+92.03x1-82.67x2+12.25x1x2-110.04x12-216.54x22 求Y 最大值，可以確定相對應(yīng)變量x1和x2的取值。預(yù)測結(jié)果如表10 所示。根據(jù)模型，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為84.08 g/L，蛋白胨為14.11 g/L 時(shí)，EPS 得率達(dá)到最大值，為881.40 mg/L。應(yīng)用模型預(yù)測出的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(n=5)，得到EPS 得率的實(shí)驗(yàn)值為917.80 mg/L，是未優(yōu)化前(87.00 mg/mL)的10.55 倍。通過t 檢驗(yàn)對EPS 得率的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行顯著性差異分析，發(fā)現(xiàn)差異并不顯著。證明該模型具有較高的實(shí)際擬合度，可用于指導(dǎo)稻綠核菌EPS 得率的調(diào)控。

表9 二次多項(xiàng)式模型的系數(shù)及其顯著性分析Table 9 Regression coefficient estimates and their significance test of quadratic polynomial model

圖3 稻綠核菌EPS 得率與葡萄糖和蛋白胨濃度的響應(yīng)面圖(A)和相應(yīng)的等高線圖(B)Fig.3 Response surface plot (A)and contour plot (B)of the EPS yield of V.virens versus the tested variables glucose and peptone

表10 稻綠核菌產(chǎn)胞外多糖最佳培養(yǎng)條件和得率Table 10 The optimal cultured conditions for EPS production of V.virens

3 結(jié)論

本研究采用Fe3+還原能力和羥基自由基清除能力抗氧化模型對稻綠核菌菌絲水提多糖(WPS)、菌絲堿提多糖(SPS)和胞外多糖(EPS)的抗氧化活性進(jìn)行了評價(jià)，EPS 表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，WPS抗氧化活性中等，稻綠核菌多糖的理化性質(zhì)和其他生物活性(如免疫調(diào)節(jié)活性等)值得進(jìn)一步研究。為了有效提高發(fā)酵培養(yǎng)液中EPS 的得率，通過Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，篩選出培養(yǎng)基中影響EPS 生產(chǎn)的主效因子為葡萄糖和蛋白胨。通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定中心組合設(shè)計(jì)(CCD)中葡萄糖和蛋白胨濃度的取值范圍分別為70～90 g/L 和10～20 g/L。采用CCD 和響應(yīng)面分析(RSM)優(yōu)化了對稻綠核菌EPS 得率具有顯著影響的葡萄糖和蛋白胨的濃度，建立了EPS 得率與這兩個(gè)研究變量之間的二次回歸模型。通過求解該模型EPS 得率最大時(shí)對應(yīng)變量的取值，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為84.08 g/L，蛋白胨濃度為14.11 g/L 時(shí)，EPS 得率達(dá)到最大值，為881.40 mg/L。應(yīng)用模型預(yù)測出的最佳培養(yǎng)基條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(n=5)，得到EPS 得率的實(shí)驗(yàn)值為917.80 mg/L，是優(yōu)化前(87.00 mg/L)的10.55 倍，且抗氧活性與優(yōu)化前無顯著性差異(數(shù)據(jù)未列出)。由于EPS 是分泌到胞外的代謝產(chǎn)物，有利于產(chǎn)物的提取和制備、便于連續(xù)培養(yǎng)和降低生產(chǎn)成本等，從而有效促進(jìn)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。研究結(jié)果為今后培養(yǎng)稻綠核菌大規(guī)模生產(chǎn)胞外多糖，以及對稻綠核菌代謝產(chǎn)物綜合開發(fā)和利用提供了依據(jù)。

1 Tanaka E，Ashizawa T，Sonoda R，et al.Villosiclava virens gen.nov.，comb.nov.，the teleomorph of Ustilaginoidea virens，the causal agent of rice false smut.Mycotaxon，2008，106:491-501.

2 Wang F，Zhang S，Liu MG，et al.Genetic diversity analysis reveals that geographical environment plays a more important role than rice cultivar in Villosiclava virens population selection.Appl Environ Microbiol，2014，80:2811-2820.

3 Li Y，Koiso Y，Kobayashi H，et al.Ustiloxins，new antimitotic cyclic peptides:interaction with porcine brain tubulin.Biochem Pharmacol，1995，49:1367-1372.

4 Lv SQ(呂仕瓊)，Liu H(劉浩)，Zhang JL(趙江林)，et al.Research progress of ustiloxins.Chin Agric Sci Bull (中國農(nóng)學(xué)通報(bào))，2010，14:265-268.

5 Shan T，Sun W，Wang X et al.Purification of ustiloxins A and B from rice false smut balls by macroporous resins.Molecules，2013，18:8181-8199.

6 Koyama K，Ominato K，Natori S et al.Cytotoxicity and antitumor activities of fungal bis (naphtho-γ-pyrone)derivatives.J Pharmacobio-Dyn，1988，11:630-635.

7 Lu S，Tian J，Sun W，et al.Bis-naphtho-γ-pyrones from fungi and their bioactivities.Molecules，2014，19:7169-7188.

8 Lu S，Sun W，Meng J，et al.Bioactive bis-naphtho-γ-pyrones from rice false smut pathogen Ustilaginoidea virens.J Agric Food Chem，2015，63:3501-3508.

9 Singh SB，Zink DL，Bills GF，et al.Four novel bis-(naphthoγ-pyrones)isolated from Fusarium species as inhibitors of HIV-1 integrase.Bioorg Med Chem Lett，2003，13:713-717.

10 Li P，Mou Y，Shan T，et al.Effects of polysaccharide elicitors from endophytic Fusarium oxysporium Dzf17 on growth and diosgenin production in cell suspension culture of Dioscorea zingiberenesis.Molecules，2011，16:9003-9016.

11 Li P，Xu L，Mou Y，et al.Medium optimization for exopolysaccharide production in liquid culture of endophytic fungus Berkleasmium sp.Dzf12.Int J Mol Sci，2012，13:11411-11426.

12 Wang Z，Luo D，Ena C.Optimization of polysaccharides extraction from Gynostemma pentaphyllum Makino using uniform design.Carbohyd Polym，2007，69:311-317.

13 Fan Y，Ge Z，Luo A.In vitro antioxidant activity of polysaccharide from Gardenia jasminoides Ellis.J Med Plants Res，2011，5:2963-2968.

14 Thirunavukarasu P，Ramanathan T，Ramkumar L，et al.The antioxidant and free radical scavenging effect of Avicennia officibalis.J Med Plants Res，2011，5:4754-4758.

15 Xu CP，Kim SW，Hwang HJ，et al.Application of statistically based experimental designs for the optimization of exo-polysaccharide production by Cordyceps militaris NG3.Biotechnol Appl Biochem，2002，36:127-131.

16 Ye M (葉明)，Li SY(李世艷)，Zhang L (張利兵)，et al.Fermentation and polysaccharide antioxidative activity of a Libertella strain.Acta Microbiol Sin (微生物學(xué)報(bào))，2008，48:1398-1402.