中國南方地區體檢人群rs9263726等位基因頻率的分析

李曉敏　張萍萍　陳澤娜　曹雙燕　魏秋靜　古潔若

510630 廣州，中山大學附屬第三醫院風濕免疫科

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中國南方地區體檢人群rs9263726等位基因頻率的分析

李曉敏張萍萍陳澤娜曹雙燕魏秋靜古潔若

510630 廣州，中山大學附屬第三醫院風濕免疫科

【摘要】目的了解中國南方地區體檢人群單核苷酸多態性(SNP)rs9263726位點等位基因頻率。方法納入中國南方地區191名健康體檢者，從全血中提取DNA，采用Sanger測序法對所有DNA樣本進行檢測，分析rs9263726位點等位基因頻率。結果rs9263726 位點突變純合子AA基因型頻率為1.57%，野生純合子 GG、突變雜合子GA的基因型頻率分別為87.43%、10.99%，A等位基因攜帶率為12.57%，頻率為7.07%。GG分型者的年齡及性別與GA及AA者比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論中國南方地區健康體檢者rs9263726位點存在突變，該突變無年齡、性別傾向性。

【關鍵詞】rs9263726；基因頻率

別嘌醇是黃嘌呤氧化酶的抑制劑，可阻止次黃嘌呤和黃嘌呤代謝為尿酸，減少尿酸的生成，是治療痛風的首選藥。隨著藥物的大量使用，其不良反應日益突出，主要是與用藥相關的藥疹情況。別嘌醇可引起中毒性表皮壞死松解癥(TEN)、重癥滲出性多形紅斑藥疹(SJS)及藥物超敏綜合征(HSS)等嚴重皮膚不良反應(SCAR)，發生率約5%，致死率高[1]。2005年Hung等[2]首次發現臺灣漢族人群HLA-B*58∶01等位基因與別嘌醇引起SCAR強相關。在中國大陸漢族人群中也隨后發現這種相關性，并且輕微型和嚴重型皮膚不良反應與HLA-B*58∶01均呈強相關[3]。但是，由于HLA分型技術及基因本身的復雜性等原因，難以在臨床檢測中普及。日本研究者Tohkin等[4]發現單核苷酸多態性(SNP)rs9263726位點A等位基因與別嘌醇引起SCAR相關，并與HLA-B*58∶01呈完全連鎖不平衡。因此，rs9263726 A等位基因期望能代替HLA-B*58∶01，成為別嘌醇致SCAR的預測因子，并指導痛風患者的用藥，而目前國內相關研究較少。為此，本研究檢測南方地區漢族體檢人群SNP rs9263726等位基因頻率，并探討其與性別、年齡的關系，現報告如下。

對象與方法

一、研究對象

2013年在我院收集191名籍貫為南方地區的漢族健康體檢者，男107名，女84名，年齡(46.6±10.2)歲，來自廣東143名，其他地區48名。入組對象血清尿酸水平均正常。

二、方法

1. 標本采集及資料收集

采集所有入組對象的靜脈血檢測rs9263726位點等位基因，同時記錄研究對象的樣本編號、性別、年齡、籍貫等資料。入組患者均已簽署知情同意書。

2. rs9263726等位基因的檢測

以鹽析法提取DNA，采用Sanger測序法對所有DNA樣本進行檢測。將提取所得模板DNA行PCR擴增。rs9263726序列來自GeneBank數據庫。應用Primer Premier 5.0設計引物，由達安基因公司合成。引物序列如下：上游5’-ACCCCACTAGCTTTGTCCTC-3’；下游 5’-GTCCTTTGCC TGCACACCA-3’，產物長度為370 bp。反應體系50 μl：模板DNA 10 μl，5倍緩沖液10 μl，5 mmol/L Betain(Sigma，美國)8 μl，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(Promega，美國) 0.5 μl，10 μmol/L 上游引物 1 μl，10 μmol/L下游引物 0.3 μl，Taq熱啟動酶(Sigma，美國)0.4 μl，重蒸水19.8 μl。PCR擴增程序為50℃ 預變性3 min，95℃變性15 min，94℃變性30 s，55℃維持40 s，72℃延伸40 s，共45個循環，最后72℃延伸7 min，4℃保存。擴增產物交由蘇州金唯智測序公司測序，用ABI 3730xl DNA分析儀的毛細管電泳和熒光染料終止技術對樣品進行分析。使用生物編輯序列校準編輯器查看測序峰圖。測序圖底峰不高，信號較均一，無衰減信號，并與美國國立生物技術信息中心(NCBI)比對確認目的序列。分析SNP rs9263726位點等位基因分型及頻率，并總結其他亞洲人群rs9263726(G>A)的相關研究結果。

三、統計學處理

結果

一、南方地區健康體檢人群SNP rs9263726位點基因型確定

191例標本測序結果如圖1所示，野生型(GG)及突變型純合子(AA)表現為單一峰，雜合型表現為套峰(AG)。

圖1　rs9263726多態性位點測序分型測序峰圖

A：rs9263726的GG野生型；B：rs9263726的GA突變雜合子；C：rs9263726的AA突變純合子

二、南方地區健康體檢人群rs9263726的基因型分布

191例標本中，GG基因型167例，頻率為87.43%；GA基因型21例，頻率為10.99%；AA基因型3例，頻率為1.57%。G為優勢等位基因，等位基因頻率為92.93%(359/382)，攜帶率為98.43(188/191)；A的等位基因頻率為7.07%(6/382)，攜帶率 12.57%(24/191)。基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=5.079，P=0.079)。

三、南方地區健康體檢人群中rs9263726不同等位基因分型者的年齡、性別比較

因GA及AA分型較少，故將其合并計算，結果示rs9263726位點GG分型者的年齡及性別與GA及AA者比較差異無統計學意義(t=0.060，P=0.953；χ2=0.038，P=0.845)，見表1。

表1　　　南方地區健康體檢人群

四、中國南方地區與其他亞洲人群rs9263726(G>A)的基因頻率分析

目前對rs9263726的研究較少，且多為地區性的小群體研究， 其他亞洲人群的rs9263726(G>A)相關研究結果見表2。

表2

國內外健康志愿者

注：ars9263726-A等位基因攜帶率；b本研究數據

討論

自2005年Hung[2]等首次報道中國臺灣漢族人51個別嘌醇致SCAR患者均攜帶HLA-B*58∶01基因后，陸續在多個國家包括中國香港和大陸等地區也發現HLA-B*58∶01與服用別嘌醇致SCAR強相關[3,7]。攜帶HLA-B*58∶01等位基因的中國漢族患者服用別嘌醇發生皮膚過敏反應的風險較未攜帶此基因型的漢族人群風險比增加339倍[3]。在中國，痛風的患病率為0.15%~1.98%，而使用別嘌呤醇治療的患者中發生HSS大約為1∶260(0.4%)，SCAR發病率和致死率增加，病死率可高達26%[8]。

2012年美國風濕病學會痛風指南指出中國漢族人和泰國人應用別嘌醇前應行HLA-B*58∶01等位基因檢測[9]。但由于HLA分型的血清學分型和基因分型各有不足，難以在臨床工作中廣泛開展。尋找替代的分子遺傳標志物成為研究重點。

最近一項中國漢族人群的HLA-B等位基因的藥物反應和疾病風險的標簽SNP研究中，發現7個SNP位點可標記HLA-B*58∶01，其中的rs9262570(C>T)T等位基因標記HLA-B*58∶01的敏感度和陰性預測值均為100%，但其陽性預測值較低，僅76.4%，未能排除假陽性情況[10]。

日本的全基因組關聯分析研究納入14例別嘌醇SJS/TEN患者和991名健康人，也提示了HLA-B*58∶01和別嘌醇相關SCAR密切相關(OR=62.8，P<0.001)[4]。該研究也發現其他幾個分別位于BAT1、HCP5、MICC和PSORS1C1基因的SNP與別嘌醇相關的SJS或TEN有關(OR>61，P<0.001)。在206例日本個體分析顯示，位于PSORS1C1 基因rs9263726的SNP與HLA-B*58∶01呈完全連鎖不平衡(r2=1.000，D’=1.000)。提示rs9263726(G>A)可作為預測日本人群發生別嘌醇致SJS/TEN的分子標志物。隨后的研究采用PCR-RFLP法檢測rs92637263種基因型，發現在日本的美籍華人rs9263726位點A等位基因頻率為0.105，遠高于當地日本人群[5]。最近，一項中國人群rs9263726(G>A)A等位基因替代HLA-B*58∶01作為預測別嘌呤醇致SCAR發生分子標志物的可行性研究發現，HLA-B*58∶01和PSORS1C1 rs9263726(G>A)多態位點間呈強連鎖不平衡(r2=0.902，D’=0.966)。rs9263726(G>A) A等位基因用于預測該人群別嘌呤醇致SCAR發生的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為91.30%、88.89%、90.32%和90.00%，提示診斷效能良好[6]。

本研究發現在中國南方地區健康體檢人群中，rs9263726(G>A)AA突變純合子攜帶率為1.57%，A等位基因頻率達7.07%。在ENSEMBL網頁數據庫搜索到的千人基因組計劃中，北京漢族人rs9263726位點A等位基因頻率為0.087(18例)；而南方漢族人等位基因頻率為0.062(13例)，遠高于日本人群的等位基因頻率0.014(3例)，且與本研究結果相符合。在Allefrequencies數據庫搜索到中國南方漢族人HLA-B*58∶01的等位基因頻率為0.089(284例)，與rs9263726位點A等位基因頻率相近。本研究中，野生型和突變型純合子與雜合子比例在性別上無差異，提示該位點突變無性別傾向性。

目前rs9263726(G>A)與HLA-B*58∶01的關聯分析尚少，樣本量不大。若rs9263726 位點A等位基因與HLA-B*58∶01的連鎖不平衡關系在其他人群也能得到證實，那么，相對易分型的rs9263726(G>A)A等位基因可望成為臨床預測別嘌醇致SCAR風險的替代分子遺傳標志物。

參考文獻

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(本文編輯：林燕薇)

Analysis of allele frequency of rs9263726 in physical examination population from South China

LiXiaomin，ZhangPingping,ChenZena,CaoShuangyan,WeiQiujing,GuJieruo.

RheumaticDepartment，theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510630,ChinaCorrespondingauthor,GuJieruo，E-mail：gujieruo@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the allele frequency of single nucleotide polymorphism (SNP) rs9263726 in the physical examination population from South China. MethodsIn this study, 191 healthy individuals receiving physical examination were enrolled. DNA sample was extracted from the whole blood and subject to Sanger sequencing to detect the allele frequency of rs9263726. ResultsThe allele frequency of variant homozygote A/A at rs9263726 was 1.57%, 87.43% for wild homozygote G/G, 10.99% for mutant heterozygote G/A. The allele frequency of A was 7.07%, and 12.57% for carrier frequency of A. Age and gender did not significantly differ between the individuals carrying G/G and their counterparts carrying G/A or A/A (both P>0.05). ConclusionsThe mutation of allele frequency of rs9263726 was observed in the physical examination population from South China. This mutation had no age or gender preponderance.

【Key words】rs9263726; Allele Frequency

(收稿日期：2015-11-20)

通訊作者，古潔若，E-mail：gujieruo@163.com

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.03.003

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