楓香樹(shù)脂毒性及抑菌活性研究

陳朱輝，陳衛(wèi)波，曾 韜*，沈徐標(biāo)

1南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京 210037;2 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京 210093

中國(guó)楓香(Liquidambar formosanaHance)是楓香屬中的一種，系金縷梅科楓香屬植物，分布于我國(guó)秦嶺及淮河以南各省，北起河南、山東，東至臺(tái)灣，西至四川、云南及西藏，南至廣東等地［1］。楓香樹(shù)干在受到外界的機(jī)械損傷，昆蟲(chóng)及病原體的侵害等情況下可產(chǎn)生創(chuàng)傷性樹(shù)脂道［2］，從而分泌出楓香脂(oleoresin of Chinese sweetgum，簡(jiǎn)稱(chēng)楓脂)。楓脂是我國(guó)特產(chǎn)的天然樹(shù)脂和優(yōu)良的藥化產(chǎn)品。曾韜等研究了“V”字形下降法割溝采集楓脂的方法［3］，為促進(jìn)我國(guó)楓脂生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)參考。楓脂經(jīng)過(guò)加工分離后，可制成液體楓香精油和固體楓香樹(shù)脂［4］。吳維茜等［5］對(duì)楓香樹(shù)脂的水蒸汽蒸餾淺色化工藝進(jìn)行了研究，生產(chǎn)出質(zhì)量較高的楓香樹(shù)脂產(chǎn)品。楓香樹(shù)脂淡黃色、透明、質(zhì)松脆，其主要成分有肉桂酸肉桂酯，肉桂酸冰片脂，五環(huán)三萜醇、酮、酸及它們的酯類(lèi)化合物［6-8］。這些化合物具有抗肝炎、抗腫瘤、抗病毒、抗炎抑菌等多種藥理作用，是我國(guó)優(yōu)良的傳統(tǒng)中藥材［9-11］。楓香樹(shù)脂是一種新型的天然藥化產(chǎn)品，目前正在開(kāi)展相關(guān)應(yīng)用研究，可望在藥品、食品和工業(yè)助劑等方面具有良好的應(yīng)用前景［12，13］。

為開(kāi)發(fā)楓香樹(shù)脂在食品、藥品、食品級(jí)膠粘劑及食品級(jí)印刷油墨等方面的應(yīng)用，需要對(duì)楓香樹(shù)脂的相關(guān)生物活性和安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。迄今，筆者尚未見(jiàn)有關(guān)楓香樹(shù)脂毒性和抑菌活性等方面的研究報(bào)道。為此，本研究進(jìn)行了楓香樹(shù)脂對(duì)昆明小鼠的急性毒性和蓄積毒性和抑菌活性的實(shí)驗(yàn)。

1 材料與儀器

1.1 供試材料、動(dòng)物及菌種

楓香樹(shù)脂，廣西產(chǎn)楓脂，經(jīng)水蒸氣蒸餾煉制［4］;六周齡雄性和雌性昆明小鼠［SCXK(蘇)2005-0002］，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供;大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 8739)、金黃色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，ATCC 6633)、假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens，ATCC 31554)、黑曲霉(Aspergillus niger，ATCC 10864)，供試菌種均由南京林業(yè)大學(xué)林產(chǎn)化工實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑

DMSO(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司);蘇木精(阿拉丁試劑公司);伊紅(阿拉丁試劑公司);青霉素(哈藥集團(tuán)制藥總廠);酮康唑(東京化成工業(yè)株式會(huì)社);丙酮(南京化學(xué)試劑有限公司)。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(細(xì)菌用):牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值為7。

土豆培養(yǎng)基(霉菌用):土豆(去皮切塊)200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1000 mL，自然pH值。

1.3 儀器

JJ-500 型精密電子天平(美國(guó)雙杰兄弟有限公司);生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司);SP-300B 生化培養(yǎng)箱(南京恒裕設(shè)備有限公司);VS-1300L-U 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰設(shè)備有限公司);D-1 型自動(dòng)蒸汽壓力滅菌鍋(北京發(fā)恩設(shè)備有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 毒性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

取50 只小鼠按灌胃劑量隨機(jī)分為5 組，分別為DMSO 對(duì)照組，2 g/kg 體重，4 g/kg 體重，8 g/kg 體重和16 g/kg 體重組，每組10 只，雌、雄各半。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食4 h，不禁水，對(duì)各劑量組進(jìn)行灌胃針灌胃給藥，給藥后觀察并且記錄小鼠的外觀、行為、對(duì)刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物和死亡情況，連續(xù)觀察14 d。對(duì)觀察期滿的小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟做組織切片，HE 染色后做病理學(xué)檢查。

2.1.2 胃排空實(shí)驗(yàn)

選取10 只小鼠，以16 g/kg 體重的劑量進(jìn)行灌胃給藥，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食4 h，不禁水，給藥后每隔一段時(shí)間對(duì)一只小鼠進(jìn)行解剖，觀察楓香樹(shù)脂在胃中的消化排空狀態(tài)，并稱(chēng)量胃中殘留楓香樹(shù)脂的質(zhì)量。

2.1.3 蓄積毒性實(shí)驗(yàn)

選取16 只小鼠，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食4 h，不禁水。分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8 只小鼠，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)組給予5 g/kg 體重楓香樹(shù)脂灌胃，每周二與周五各灌胃一次，連續(xù)8 周，記錄小鼠的體重變化和行為改變。最后一次灌胃后一周處死小鼠，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟做病理學(xué)檢查。

2.2 抑菌活性測(cè)定

供試菌懸液的制備:在相對(duì)應(yīng)的含有固體培養(yǎng)基的平板上，30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)菌活化24 h，真菌活化72 h。用無(wú)菌接種環(huán)挑取生長(zhǎng)良好的菌落充分分散于無(wú)菌水中，調(diào)至濃度為106～107CFU/mL，備用。

含菌平板的制備:將配置好的培養(yǎng)基倒入100 mL 錐形瓶中，每瓶75 mL，滅菌后冷卻至50 ℃左右，在無(wú)菌工作臺(tái)上，在每個(gè)錐形瓶中加入15 mL 的菌懸液，混勻后趁熱向已滅菌的培養(yǎng)皿中倒入15 mL/皿培養(yǎng)基，冷卻后即為含菌平板。

抑菌活性測(cè)定:采用紙片法，用打孔器制得直徑為6 mm 的圓形濾紙片，滅菌后備用。配制濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078 mg/mL 的楓香樹(shù)脂溶液(溶劑為丙酮)。用無(wú)菌移液槍吸取10 μL 楓香樹(shù)脂溶液滴加在圓形濾紙片上，烘干后貼在含菌平板上，每個(gè)濃度做3 組平行實(shí)驗(yàn)，每皿貼濾紙片6 片。用滴加丙酮溶液的濾紙片做陰性對(duì)照，用滴加濃度為0.1 mg/mL 的青霉素水溶液的濾紙片為細(xì)菌抑菌的陽(yáng)性對(duì)照，用滴加濃度為0.1 mg/mL 的酮康唑丙酮溶液的濾紙片為真菌抑菌的陽(yáng)性對(duì)照。在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)菌培養(yǎng)24 h，真菌培養(yǎng)72 h。測(cè)量抑菌圈的直徑，結(jié)果取平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 毒性實(shí)驗(yàn)

3.1.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

小鼠灌胃給藥后，經(jīng)14d 觀察，記錄小鼠的死亡情況，結(jié)果見(jiàn)下表1。

由表1 可知，所有劑量組的小鼠死亡率為0，無(wú)小鼠死亡。且14 d 內(nèi)小鼠的外觀、行為、對(duì)刺激的反應(yīng)、分泌物及排泄物無(wú)異常。取其主要臟器做病理學(xué)檢查中，小鼠的主要臟器組織切片的HE 染色結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞膜完整，沒(méi)有炎癥反應(yīng)和細(xì)胞壞死，并沒(méi)有明顯的病理學(xué)變化。由此可以確定給小鼠灌服16 g/kg 的楓香樹(shù)脂后，仍沒(méi)有出現(xiàn)中毒死亡，即可以認(rèn)為楓香樹(shù)脂的LD50＞16 g/kg。按照毒理學(xué)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［14］，所用劑量顯著高于5g/kg 體重的無(wú)毒安全劑量，這表明楓香樹(shù)脂屬于實(shí)際無(wú)毒類(lèi)物質(zhì)。

表1 急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠死亡率Table 1 Death rate of mouse in acute toxicity test

圖1 急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟石蠟切片HE 染色圖Fig.1 Paraffin sections HE staining of heart，liver，spleen，lung，kidney of mice in acute toxicity test

3.1.2 胃排空實(shí)驗(yàn)

楓香樹(shù)脂的胃排空實(shí)驗(yàn)是為了觀察楓香樹(shù)脂在小鼠胃中能否正常消化排空以及排空所需時(shí)間，以16 g/kg 體重的劑量灌胃后的排空結(jié)果如下圖2、3所示。

圖2 為小鼠腹部解剖圖，箭頭所指的是殘留楓香樹(shù)脂的位置，其中左圖是小鼠灌胃2 h 后的解剖圖，可見(jiàn)小鼠的胃中有楓香樹(shù)脂的殘留，且小鼠小腸中也開(kāi)始出現(xiàn)楓香樹(shù)脂，說(shuō)明楓香樹(shù)脂已經(jīng)開(kāi)始被消化排泄。右圖是小鼠灌胃16 h 后的腹部解剖圖，其中小鼠胃中已無(wú)楓香樹(shù)脂殘留，只有結(jié)腸中有小塊楓香樹(shù)脂殘留，說(shuō)明楓香樹(shù)脂已完全排空。

圖2 小鼠腹部解剖圖Fig.2 Mouse abdominal anatomy

圖3 是小鼠胃內(nèi)楓香樹(shù)脂殘留狀況，由圖中可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠胃中殘留的楓香樹(shù)脂量越來(lái)越少。結(jié)合圖2 可知，在灌胃16 h 后，楓香樹(shù)脂完全排空。由此可以說(shuō)明楓香樹(shù)脂在小鼠胃中會(huì)隨著時(shí)間慢慢消化排出，不會(huì)在胃中積留，可完全排空。

圖3 小鼠胃內(nèi)楓香樹(shù)脂殘留狀況Fig.3 Residual properties of Chinese sweetgum resin in mice stomach

3.1.3 蓄積毒性實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)9 周的實(shí)驗(yàn)和觀察，兩組中所有小鼠均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，小鼠的外觀、行為、對(duì)刺激的反應(yīng)、分泌物及排泄物均無(wú)異常。在9 周的實(shí)驗(yàn)期間，小鼠的體重變化見(jiàn)圖4 所示。

圖4 小鼠體重變化Fig.4 Changes of mice body weight

由圖4 可知，實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重與對(duì)照組小鼠無(wú)明顯差異，說(shuō)明給小鼠灌服楓香樹(shù)脂并未影響小鼠的正常生長(zhǎng)。主要臟器的組織切片HE 染色結(jié)果見(jiàn)圖5 所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組各臟器細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的空泡化，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞膜完整，未見(jiàn)細(xì)胞壞死，未見(jiàn)炎癥反應(yīng)，并沒(méi)有明顯的病理學(xué)變化。可以說(shuō)明楓香樹(shù)脂對(duì)小鼠無(wú)明顯的蓄積毒性作用。

圖5 蓄積毒性實(shí)驗(yàn)小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟石蠟切片HE 染色圖Fig.5 Paraffin sections HE staining of the heart，liver，spleen，lung，kidney of mice in accumulative toxicity test

3.2 抑菌活性實(shí)驗(yàn)

采用濾紙片法研究楓香樹(shù)脂的抑菌活性，其結(jié)果由表2 和圖6 可見(jiàn)，楓香樹(shù)脂對(duì)4 種細(xì)菌均有抑制作用，但對(duì)黑曲霉卻沒(méi)有抑菌效果。在4 種細(xì)菌中，對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑制作用較強(qiáng)，在10 mg/mL 濃度的抑菌圈直徑分別為20.3 mm 和18.6 mm，表明其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較好的抑制效果;對(duì)大腸桿菌和假單胞桿菌的抑制作用相對(duì)較弱，在10 mg/mL 濃度的抑菌圈直徑分別為12.4 mm 和13.1 mm，表明其對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制效果較弱。

由表2 還可看出，隨著楓香樹(shù)脂的濃度降低，對(duì)細(xì)菌的抑制能力也隨之減弱，可知楓香樹(shù)脂對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞桿菌、枯草桿菌各受試菌的最小抑制濃度(MIC)分別是0.156、0.3125、0.625、0.3125 mg/mL。

表2 不同濃度的楓香樹(shù)脂的抑菌活性Table 2 Bacteriostatic activity of different concentrations of Chinese sweetgum resin

圖6 楓香樹(shù)脂對(duì)四種細(xì)菌的抑菌圈Fig.6 Inhibitory zone of Chinese sweetgum resin against 4 bacteria

4 討論與結(jié)論

急性毒性和蓄積毒性實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)外源物質(zhì)安全性的重要指標(biāo)。急性毒性實(shí)驗(yàn)是藥物毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)的第一步，具有了解受試物急性毒性強(qiáng)弱的作用。LD50是評(píng)價(jià)受試物急性毒性強(qiáng)弱以及比較其急性毒性大小的一個(gè)常用指標(biāo)。LD50數(shù)值越大，則表明受試物急性毒性越弱、越小;反之，急性毒性就越強(qiáng)、越大。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定楓香樹(shù)脂對(duì)小鼠的LD50＞16 g/kg，根據(jù)毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［14］，楓香樹(shù)脂屬于實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。

外源物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的蓄積作用是引起亞慢性毒性作用和慢性毒性作用的基礎(chǔ)。人們?cè)谕庠次镔|(zhì)毒理學(xué)評(píng)定的實(shí)際工作中，可根據(jù)受試物的蓄積毒性強(qiáng)弱作為評(píng)估它的毒性作用指標(biāo)之一，也是制定衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時(shí)選用安全系數(shù)大小的重要參考依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以5 g/kg 體重的劑量長(zhǎng)時(shí)間給小鼠灌服后，未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)死亡，與對(duì)照組相比，小鼠可以正常生長(zhǎng)，平均體重的增加和重要臟器的病理學(xué)檢查均未見(jiàn)差異，說(shuō)明楓香樹(shù)脂在小鼠體內(nèi)無(wú)蓄積毒性。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌、枯草桿菌、黑曲霉等對(duì)食品衛(wèi)生、臨床醫(yī)學(xué)和一些生物材料具有嚴(yán)重的危害和影響。楓香樹(shù)脂作為一種天然植物資源，對(duì)上述細(xì)菌都有不同程度的抑制作用，MIC 值分別為0.3125(大腸桿菌)、1.25(假單胞桿菌)、0.156 mg/mL(金黃色葡萄球菌)和0.3125 mg/mL(枯草芽孢桿菌)。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以初步判定楓香樹(shù)脂在相關(guān)藥、食產(chǎn)品方面的使用是安全的。本實(shí)驗(yàn)研究為今后更進(jìn)一步的毒理學(xué)研究及相關(guān)藥、食產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 Zhang HD (張宏達(dá)).Flora of China (中國(guó)植物志).Beijing:Science Press，1979.55.

2 Zeng T (曾韜)，Song X (宋曉)，Zeng C (曾誠(chéng)).Study on the methods of the tapping from Chinese sweet gum.China For Sci Tech(林業(yè)科技開(kāi)發(fā))，2010，24:84-87.

3 Zeng T (曾韜)，Song X (宋曉)，Zeng C (曾誠(chéng)).A method of collection of oleoresin of Chinese sweetgum (一種采集楓香脂的方法).ZL201010617196.0.

4 Song X (宋曉)，Zeng T (曾韜).Study on process of steam distillation of Chinese sweetgum resin.Bio Chem Eng(生物質(zhì)化學(xué)工程)，2010，44(6):10-13.

5 Wu WQ (吳維茜)，Song X (宋曉)，Zeng T (曾韜)，et al.Study on process of decolorization of Chinese sweetgum resin.China For Sci Tech(林業(yè)科技開(kāi)發(fā))，2013，27:105-107.

6 Yonkov LK，Ivanov CP，F(xiàn)am TT，Comptes Rendus de Academie Bulgare des Sciences (Dakl.Bolg.Akad.Nauk.)1980，75:33.

7 Liu C (劉馳)，Xu JF (徐金富)，He QM (何其敏)，et al.Chemical components of theLiquidambar formosanaH.resin.Org Chem(有機(jī)化學(xué))，1991，11:508-510.

8 Wu WQ (吳維茜).Study on technology of decolorization component analysis of Chinese sweetgum resin.Nanjing:Nanjing Forestry University (南京林業(yè)大學(xué))，MSc.2013.

9 Shan JZ，Xuan YY，Zheng S，et al.Ursolic acid inhibits proliferation and induces apoptosis of HT-29 colon cancer cells by inhibiting the EGFR/MAPK pathway.Zhejiang Univ Sci B，2009 10:668-674.

10 Zhang PX，Li HM，Chen D，et al.Oleanolic acid induces apoptosis in human leukemia cells through caspase activa?tion and poly(ADP-ribose)polymerase cleavage.Acta Biochim Biophys Sin，2007，39:803-809.

11 Saraswati S，Agrawal SS，Alhaider AA，et al.Ursolic acid inhibits tumor angiogenesis and induces apoptosis through mitochondrial-dependent pathway in Ehrlich ascites carcinoma tumor.Chem-Biol Inter，2013，206:153-165.

12 Xing ZZ (邢珍珍)，Wu WQ (吳維茜)，Zeng T (曾韜).Tackifying effect of sweetgum resin in SIS hot melt adhesive.Chem Ind For Prod(林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè))，2014，34(2):51-55.

13 Xing ZZ (邢珍珍)，Chen ZH (陳朱輝)，Zeng T (曾韜).Study on preparation of Chinese sweetgum resin/ acrylate composite emulsion and properties of the pressure sensitive adhesive.J Fujian For Sci Tech(福建林業(yè)科技)，2014，41(3):94-99.

14 Shen JZ (沈建忠).Animal Toxicology (動(dòng)物毒理學(xué)).Beijing:China Agriculture Publishing House，2002.83-102.