酶法聯(lián)合閃式提取紅葉李花多糖及單糖初步分析

衛(wèi) 強(qiáng)，紀(jì)小影

安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，合肥 230088

紅葉李［Prunus cerasiferaEhrh.cv.AtropurpureaJacg.］又名紫葉李或櫻桃李，是落葉喬木，為薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬(Prumus)植物，原產(chǎn)于亞洲，為我國(guó)最常用的城市景觀植物之一［1］。紅葉枝和葉呈褐紅，有光澤，花色粉紅，深紅色果實(shí)。以葉色聞名，在整個(gè)生長(zhǎng)期葉色呈紫紅色，尤其春秋兩季葉色更艷，且具有較強(qiáng)的耐濕、耐寒力，為園林常用的彩葉樹種，極具觀賞價(jià)值［2，3］。現(xiàn)代研究表明，紅葉李枝葉中黃酮類成分含量豐富，以山奈酚較為突出［4］。紅葉李葉中紅色素可經(jīng)80%乙醇提取得到，紅色素在酸性下穩(wěn)定，而中性和堿性下不穩(wěn)定，且不耐熱［5］。進(jìn)一步研究紅葉李葉、枝不同方位和部位中花色素含量分布情況表明，朝南方葉、枝優(yōu)于朝北方，葉中花青素含量?jī)?yōu)于枝條［6］。

植物多糖具有良好的降血糖、降血脂［7］、抗腫瘤［8］、免疫調(diào)節(jié)作用［9］和改善學(xué)習(xí)記憶能力［10］等，目前對(duì)紅葉李花中多糖的提取和單糖組成研究鮮有報(bào)道。植物細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)，多糖成分與維生素、蛋白質(zhì)、果膠、淀粉、植物纖維等成分共存，普通提取難以破壁溶解，提取率較低［11］。酶解作用可破壞細(xì)胞壁致密結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁組織水解，打開胞內(nèi)成分溶出的屏障，解決多糖的溶出問(wèn)題。閃式技術(shù)也具有高效破壁功能，酶法與閃式聯(lián)合使用可有效發(fā)揮破壁功能，大大提高對(duì)多糖的提取效能。本文對(duì)紅葉李花中多糖類成分進(jìn)行酶法和閃式提取，以DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G-150 進(jìn)行分離純化得到多糖的組分，對(duì)多糖組分進(jìn)行乙酰化，以氣相色譜-質(zhì)譜(GCMS)初步分析其單糖組成，可為其多糖進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

紅葉李花采自合肥大蜀山區(qū)，經(jīng)安徽新華學(xué)院李啟照副教授鑒定為薔薇科植物紅葉李(Prunus cerasiferaEhrh.cv.AtropurpureaJacg.)的花。復(fù)合酶(其中纖維素酶5000 IU/g、酸性蛋白酶2000 IU/g、果膠酶2000 IU/g、木聚糖酶5000 IU/g，寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。鼠李糖(批號(hào):111668-200602)、阿拉伯糖(批號(hào):111506-200001)、木糖(批號(hào):111508-200404)、甘露糖(批號(hào):140651-200602)、葡萄糖(批號(hào):110833-201205)、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):100226-201105)(中國(guó)藥品生物制品鑒定院，含量均為98%以上)，其它試劑均為分析純，水為純化水。

JHBE-50 型閃式提取器(河南金鼎科技發(fā)展有限公司);LDZ4-1.2 型低速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司);KJ-SY-150 超聲提取器(北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司);CNWB-C 型微波萃取器(廣州萬(wàn)程微波設(shè)備有限公司);UV-4802 型紫外-可見分光光度計(jì)(美國(guó)尤尼柯儀器有限公司);Agilent 6890-5973N 氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);FA1004 型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取方法

2.1.1 酶法聯(lián)合煮沸提取

精密稱取干燥紅葉李花粗粉5 g 兩份，一份置于于500 mL 具塞錐形瓶中，加入100 mL 蒸餾水浸泡12 h，再加入0.1%的植物復(fù)合酶35 ℃酶解2 h，再加入200 mL 蒸餾水煮沸提取2 h。另一份不加酶，直接加入300 mL 蒸餾水同前煮沸提取。

2.1.2 酶法聯(lián)合超聲提取

精密稱取干燥紅葉李花粗粉5 g 兩份，一份同2.1.1 酶解后，再加入200 mL 蒸餾水超聲提取30 min，超聲功率2 kW。另一份不加酶，直接加入300 mL 蒸餾水同前超聲提取。

2.1.3 酶法聯(lián)合微波提取

精密稱取干燥紅葉李花粗粉5 g 兩份，一份同2.1.1 酶解后，再加入200 mL 蒸餾水微波提取5 min，微波功率2 kW。另一份不加酶，直接加入300 mL 蒸餾水同前微波提取。

2.1.4 酶法聯(lián)合閃式提取

精密稱取干燥紅葉李花粗粉5 g 兩份，一份同2.1.1 酶解后，再加入200 mL 蒸餾水閃式提取3 min，功率2 kW。另一份不加酶，直接加入300 mL蒸餾水同前閃式提取。

上述提取方法均重復(fù)3 次，每次提取液均減壓回收至約100 mL，以石油醚萃取、Sevag 法除蛋白，取少量樣品過(guò)0.45 μm 濾膜，稀釋適當(dāng)倍數(shù)按照2.2 項(xiàng)下測(cè)定多糖含量。

2.2 多糖含量測(cè)定

［12］，精密稱取20.56 mg 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，以蒸餾水定容于100 mL 容量瓶。精密移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于8 只10 mL 刻度試管中，分別加入蒸餾水至2 mL，再分別加入1.0 mL 的5%的苯酚溶液及7 mL 的濃硫酸溶液，搖勻，水浴加熱25 min，冷卻至室溫，以去離子水為空白對(duì)照，在490 nm 下測(cè)定吸光度，以吸光度A1為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度C1為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線A1=0.0036C1-0.0024，線性范圍為0～16.45 μg/mL，測(cè)定樣品總糖得率。

分別精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于10 mL 刻度試管中，分別加入蒸餾水定容至4 mL，再分別加入5 mL濃度為6.5 mg/mL 的二硝基水楊酸(DNS)溶液，搖勻，沸水浴中加熱5 min，冷卻至室溫，蒸餾水定容至10 mL，于540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度A2為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度C2為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線A2=0.0049C2-0.0042，線性范圍為0～16.45 μg/mL，測(cè)定樣品還原糖得率。多糖得率計(jì)算公式為:

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

因酶解與提取為兩個(gè)不同的處理過(guò)程，涉及因素多，為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，將單因素實(shí)驗(yàn)分成單因素實(shí)驗(yàn)一和單因素實(shí)驗(yàn)二分別考察。

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)一

設(shè)定閃式提取因素(提取時(shí)間2 min，液料比20倍，轉(zhuǎn)速2000 rpm)，當(dāng)酶解2 h 和酶用量0.10%時(shí)，研究酶解溫度(15、25、35、45、55、60 ℃)的多糖得率;當(dāng)酶解溫度35 ℃和酶用量0.10%時(shí)，研究酶解時(shí)間(0.5、1、2、3、4、5 h)的多糖得率;當(dāng)酶解溫度35 ℃和酶解時(shí)間3 h 時(shí)，研究酶用量(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3%)的多糖得率。

2.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)二

設(shè)定酶解因素(酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間2 h，酶加入量0.17%)，當(dāng)液料比20 倍，轉(zhuǎn)速2000 rpm時(shí)，研究提取時(shí)間(1、2、3、4、5、6 min)的多糖得率;當(dāng)提取時(shí)間4 min，轉(zhuǎn)速2000 rpm 時(shí)，研究不同液料比(10，20，30，40，50，60 倍)的多糖得率;當(dāng)提取時(shí)間4 min，液料比40 倍時(shí)，考察不同轉(zhuǎn)速(1000、2000、3000、4000、5000、6000 rpm)的多糖得率。

2.4 響應(yīng)面分析

以Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。見表1。

表1 酶法提取響應(yīng)面因素及水平Table 1 Factors and levels of the enzymatic extraction of polysaccharides

2.5 多糖的單糖組分分析

將紅葉李花提取總多糖以蒸餾水溶解配制成濃度為120 mg/mL 的溶液，離心后取上清液1 mL 上DEAE-52 纖維素柱(1.5 cm ×60 cm)，以蒸餾水及0.1、0.2、0.4、0.6 mol/L 氯化鈉溶液依次洗脫，流速為0.5 mL/min，每管收集量為3 mL，于490 nm 處以苯酚-硫酸測(cè)定吸光度，繪制洗脫曲線。洗脫液濃縮，再經(jīng)透析、濃縮、干燥，得紅葉李花粗多糖(簡(jiǎn)稱PCS)。多糖溶解于5 mL 蒸餾水中，離心得上清液過(guò)Sephadex G-150 凝膠柱，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤測(cè)吸光值，繪制洗脫曲線，按照洗脫峰收集合并組分，透析冷凍干燥得精多糖Ⅰ(簡(jiǎn)稱PPCS-Ⅰ)和精多糖Ⅱ(簡(jiǎn)稱PPCS-Ⅱ)。

衍生化處理:稱取精多糖Ⅰ、精多糖Ⅱ和等量的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品分別加入蒸餾水溶解，加入硼氫化鈉還原3 h，以冰乙酸調(diào)pH 4～5，加入甲醇，濃縮至干。加入醋酐，90 ℃下水浴1.5 h，冷卻，加入甲苯3 mL，N2吹干，加入乙醇，反復(fù)吹干3 次后，2 mL 三氯甲烷萃取，過(guò)濾得乙酰化產(chǎn)物。

GC-MS 條件:氣相色譜配毛細(xì)管管柱(HP-5，30×0.32 mm ×0.25 μm);氮?dú)猓魉? mL/min。進(jìn)樣量1 μL;程序升溫:柱初始溫度160 ℃，以6 ℃/min升至200 ℃，保持6 min;進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為250℃。質(zhì)譜條件:EI 電離源，電離電壓70 eV;離子源溫度250 ℃;掃描范圍:m/z 30～600;分流比:30∶1。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取方法

由表2 可知，酶處理前煮沸法、超聲、微波和閃式提取的平均提取率為5.14 ±0.75%，加酶后平均提取率提高至7.20 ±0.52%，可見酶處理對(duì)多糖得率有較大貢獻(xiàn)。從酶處理和提取方式的結(jié)合角度考慮，酶法聯(lián)合閃式提取多糖得率最高，提取率達(dá)到7.98%。

表2 不同提取方法提取多糖的比較(± s，n=3)Table 2 Comparison of different extraction methods(± s，n=3)

表2 不同提取方法提取多糖的比較(± s，n=3)Table 2 Comparison of different extraction methods(± s，n=3)

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

圖1 酶解溫度(a)、酶解時(shí)間(b)、酶用量(c)、提取時(shí)間(d)、料液比(e)及轉(zhuǎn)速(f)對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effects of enzymatic temperature (a)，enzymatic time (b)，enzyme dosage (c)，extraction time (d)，liquid-solid ratio (e)and speed of revolution (f)on polysaccharides yield

結(jié)果見圖1(a～f)。由圖1a 可知，隨著酶解溫度的提高，多糖得率逐步提高，但溫度高于45 ℃，可導(dǎo)致酶解迅速，性能下降，故酶解溫度在35～45 ℃為宜。圖1b 顯示，酶解2～3 h 有利于發(fā)揮最佳酶解效果。圖1c 顯示，隨著酶用量加大，多糖得率逐步提高，酶用量＞0.20%時(shí)多糖得率幾乎不變，以0.15%～0.20%為宜。圖1d 顯示，隨著提取時(shí)間的增加，多糖得率逐步提高，但提取時(shí)間＞4 min 時(shí)多糖得率反而略有下降，這可能與瞬間產(chǎn)生的熱能對(duì)成分影響有關(guān)。圖1e 顯示，隨著液料比倍數(shù)的增加，多糖得率顯著增加，以30～40 倍為宜。圖1f 顯示，隨著轉(zhuǎn)速的增加，多糖得率持續(xù)增加，但轉(zhuǎn)速＞4000 rpm 時(shí)增加緩慢，考慮到能耗因素，以3000～4000 rpm 較合適。

3.3 響應(yīng)面分析

3.3.1 酶法響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度、酶解時(shí)間和酶加入量三個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken 中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、3、4 和圖2(a～c)。

表3 酶法響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design and results of response surface methodology of the enzymatic extraction

表4 酶法回歸分析結(jié)果Table 4 The results of variance analysis of the enzymatic extraction

由表4 可知，A、B、C三個(gè)因素，AB、AC、BC交互因素和B2、C2二次響應(yīng)面模型效果極顯著(P＜0.01)，表明三個(gè)因素及其交互作用對(duì)紅葉李花多糖得率均有顯著影響。由圖2a 可知，酶解時(shí)間在2 min 和酶解溫度在35 ℃時(shí)多糖得率較低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溫度的提高，多糖得率逐步提高。但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度過(guò)高反而會(huì)降低多糖得率。由圖2b 可知，隨著酶用量加大和酶解時(shí)間延長(zhǎng)，多糖得率呈現(xiàn)平穩(wěn)增長(zhǎng)，又平穩(wěn)下降的趨勢(shì)，表明兩者交互作用相對(duì)較弱。由圖2c 可知，隨著酶用量增加和酶解溫度提高，多糖得率呈現(xiàn)大幅度增加，后又明顯下降，提示兩者交互作用明顯。說(shuō)明酶用量需要與溫度協(xié)調(diào)，達(dá)到酶解細(xì)胞壁的臨界點(diǎn)，同時(shí)不致水解多糖結(jié)構(gòu)，才能提高提取效果。

對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，得回歸方程為:

優(yōu)化后模型R2=0.9993，失擬向檢驗(yàn)(lack offit)P值為0.8785，不顯著，表明模型充分?jǐn)M合。以軟件Expert-design 8.0 預(yù)測(cè)酶法最佳工藝為:酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為2 h，酶用量為0.17%。

圖2 酶解時(shí)間和酶解溫度(a)、酶用量和酶解時(shí)間(b)、酶用量和酶解溫度(c)、液料比和提取時(shí)間(d)、轉(zhuǎn)速和提取時(shí)間(e)及轉(zhuǎn)速和液料比(f)對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plots showing mutual effects of enzymatic time and enzymatic temperature (a)，enzyme dosage and enzymatic time (b)，enzyme dosage and enzymatic temperature (c)，liquid-solid ratio and extraction time (d)，speed of revolution and extraction time (e)as well as speed of revolution and liquid-solid ratio (f)

3.3.2 閃式提取響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

選擇3.3.1 最佳工藝優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行酶解。同時(shí)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間、液料比和轉(zhuǎn)速三個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken 中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5～7 和圖2(d～f)。

表5 閃式提取響應(yīng)面因素及水平Table 5 Factors and levels of the smashing tissue extraction

表6 閃式提取響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Design and results of response surface methodology of smashing tissue extraction

表7 閃式提取回歸分析結(jié)果Table 7 The results of variance analysis of the smashing tissue extraction

由表7 可知，X、XY、YZ、X2、Y2、Z2對(duì)多糖得率影響極顯著(P＜0.01)由圖2d 和2e 可知，提取時(shí)間在3～4 min 內(nèi)多糖得率呈現(xiàn)快速增加，快速降低的趨勢(shì)，而液料比在30～40 倍和轉(zhuǎn)速在3000～4000 rpm 范圍內(nèi)曲面較平直，對(duì)多糖提取影響較小。說(shuō)明在所選的液料比和轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)均可顯著提升對(duì)多糖的提取，而提取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。由圖2f 分析可知，隨著液料比倍數(shù)和轉(zhuǎn)速的增加，多糖得率平穩(wěn)增加，且兩個(gè)因素對(duì)多糖提取影響相近，交互作用顯著。

對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，得回歸方程為:

優(yōu)化后模型R2=0.9995，失擬向檢驗(yàn)P值為0.9805，不顯著，表明模型充分?jǐn)M合。以軟件Expert-design 8.0 預(yù)測(cè)酶法最佳工藝為:提取時(shí)間為3 min，液料比35 倍，轉(zhuǎn)速為3000 rpm。

3.3.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，得出紅葉李花多糖提取最優(yōu)工藝參數(shù)為:酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為2 h，酶用量為0.17%，閃式提取時(shí)間為3 min，液料比35 倍，轉(zhuǎn)速為3000 rpm。多糖得率理論值為13.10%。以上述條件進(jìn)行工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得多糖得率實(shí)際值為13.02%(n=3，RSD=1.01%)，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)偏差較小，說(shuō)明工藝穩(wěn)定。

3.4 多糖的單糖組分分析

如圖3a 所示，紅葉李花多糖經(jīng)DEAE-52 柱層析，得到兩個(gè)峰，表明多糖由兩種不同組成的組分構(gòu)成。如圖3b 和3c，利用SephadexG-150 層析柱對(duì)組分進(jìn)一步分離純化，均出現(xiàn)單一狹窄的對(duì)稱峰，得到PPCS-I 和PPCS-II 兩種多糖組分純品。

圖3 DEAE-52 纖維素柱洗脫(a)、Sephadex G-150 洗脫得PPCS-Ⅰ(b)及Sephadex G-150 洗脫得PPCS-Ⅱ(c)的洗脫曲線Fig.3 Elution curves of DEAE-52 cellulose column chromatography (a)，PPCS-Ⅰby Sephadex G-150 (b)and PPCS-Ⅱby Sephadex G-150 (c)

由圖4a 對(duì)照可知，圖4b 顯示PPCS-I 由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖構(gòu)成，摩爾比為12.11∶3.16∶7.06∶1∶4.92，圖4c 顯示PPCS-II 由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為5.02∶1∶13.65∶11.76∶8.39。

圖4 單糖標(biāo)準(zhǔn)品(a)、PPCS-I(b)及PPCS-II(c)的GC-MS 總離子圖Fig.4 GC-MS total ion chromatograms of standard monosaccharide (a)，PPCS-I (b)and PPCS-II (c)

4 結(jié)論

多糖分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且與蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等大分子共存，提取難度大。采用酶法與閃式聯(lián)合提取方法，既可以達(dá)到快速破壁的效果，又避免了高溫對(duì)糖鏈和結(jié)構(gòu)的破壞。其最佳工藝條件為:酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為2 h，酶用量為0.17%，閃式提取時(shí)間為3 min，液料比35 倍，轉(zhuǎn)速為3000 rpm。多糖實(shí)際得率達(dá)到13.02%。由DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G-150 分離純化，對(duì)PPCS-I 和PPCS-II純品進(jìn)行GC-MS 分析，得到其單糖組成和比例分別為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖(12.11∶3.16∶7.06∶1∶4.92)，鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖(5.02∶1∶13.65∶11.76∶8.39)。本文為紅葉李花中多糖的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

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