響應(yīng)面法優(yōu)化黃參多糖的提取工藝及其體外抗氧化活性

徐運(yùn)飛 ，劉 琴，宋 珅，魏燕霞，王風(fēng)霞，高清雅，趙 敏，張 繼*

1西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2 甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心;3西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，蘭州 730070

黃參是傘形科(Umbelliferae)屬的單種植物迷果芹(Sphallerocarpus gracilis)的肉質(zhì)根，呈淡黃色，外形酷似人參，故又名黃參。據(jù)經(jīng)典本草著作《晶珠本草》記載:迷果芹澀、溫、治黃水病，腎病、腰痛、腫痛，腎腰寒氣病(藏藥志)迷果芹全草均可入藥，可祛風(fēng)濕，可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［1-4］。邸多隆［5］等用60%～70%的黃參多糖提取物、0.1%～0.5%的阿斯巴甜、0.3%～1.0% 的L-薄荷腦、27%～37%的D-甘露糖醇、0.3%～1.0%的微粉硅膠及0.4%～1.5%的硬脂酸鎂制備了一種黃參多糖含片，該含片口感好，具有增強(qiáng)免疫力、降血壓、血糖和血脂的作用。

常規(guī)熱水法是實(shí)驗(yàn)室提取多糖最常用的方法之一，具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，最重要的是與其它方法相比，對(duì)天然活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響小，因此被廣泛應(yīng)用于包括多糖的水溶性活性成分的提取研究。

許多研究都表明［6］，氧化與人類(lèi)的許多疾病諸如癌癥、動(dòng)脈硬化等的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，例如自由基引發(fā)的氧化現(xiàn)象是機(jī)體衰老的主要原因。適當(dāng)攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以抑制所產(chǎn)生的自由基對(duì)機(jī)體造成的損傷，切斷過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，幫助機(jī)體抵御和防治相關(guān)疾病，延緩衰老維持機(jī)體健康［7］。目前對(duì)于黃參多糖的研究較少，對(duì)其活性的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃參多糖的抗氧化活性做了研究，以期為黃參的高值化開(kāi)發(fā)利用和黃參多糖研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

黃參(甘肅省，山丹縣)，經(jīng)西北師范大學(xué)張繼教授鑒定為傘形科迷果芹屬。60 ℃下干燥48 h，粉碎，過(guò)100 目篩，備用。

氯仿(分析純)，忠義化工;NaOH(分析純)，天津凱信化工有限公司;無(wú)水乙醇，天津精細(xì)化工廠(chǎng);HCl(分析純)，西安化學(xué)試劑廠(chǎng)，纖維素酶(2 萬(wàn)U/g)，北京衛(wèi)諾恩生物技術(shù)有限公司;木瓜蛋白酶(65萬(wàn)U/g)，上海信裕生物科技有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，四唑氮藍(lán)(NBT)，還原型輔酶Ⅰ(NADH)，吩嗪硫酸甲酯(PMS)，水楊酸，三氯乙酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，抗壞血酸(Vc)，K2HPO4，KH2PO4，鐵氰化鉀，均為分析純。

1.2 儀器

BL320H 型電子天平，日本島津;JRA-6 型數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司;FSH-2A 型可調(diào)高速分散器，常州華冠儀器制造有限公司;KQ-400GKDV 型實(shí)驗(yàn)用超聲儀(恒定功率250W)，常州諾基儀器有限公司;TDL5M 型臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)廠(chǎng);LGJ-185 型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司;SB-35型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA;UV1000 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Labtech;SHB-Ⅲ型多用循環(huán)真空泵等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 常規(guī)熱水提取法提取黃參多糖

黃參在60 ℃下干燥48 h，粉碎，過(guò)100 目篩，備用。取一定量粉碎過(guò)篩后的黃參粉末，以蒸餾水為溶劑，以一定的料液比、提取時(shí)間和提取溫度條件下常規(guī)熱水提取黃參多糖。提取液經(jīng)4000 rpm 離心10 min，取上清60 ℃減壓濃縮，加入無(wú)水乙醇至終濃度為80%，醇沉24 h，5000 rpm 離心10 min，取下層沉淀，-60 ℃冷凍干燥得到黃參粗多糖。黃參粗多糖經(jīng)木瓜蛋白酶和Sevage 偶聯(lián)法脫去蛋白，60 ℃減壓濃縮，加入無(wú)水乙醇醇沉24 h，5000 rpm 離心10 min，取下層沉淀，-60 ℃冷凍干燥得到黃參多糖。

2.2 多糖得率的計(jì)算［8，9］

將冷凍干燥后未經(jīng)脫蛋白的粗多糖在電子天平上進(jìn)行稱(chēng)重得到黃參多糖的質(zhì)量，用以下公式進(jìn)行計(jì)算黃參粗多糖的得率:

2.3 常規(guī)熱水提取法提取黃參多糖的單因素實(shí)驗(yàn)

影響熱水提取黃參多糖得率的主要因素有料液比、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)等。本實(shí)驗(yàn)中提取次數(shù)分別選取1 次、2 次、3 次、4 次和5 次五個(gè)水平，其他參數(shù)為:料液比1∶30(g/mL)，提取時(shí)間5 h，提取溫度80 ℃;料液比(原料∶水)選取1 ∶10、1∶20、1∶30、1∶40 和1∶50(g/mL)五個(gè)水平，其他參數(shù)為:提取時(shí)間5 h，提取溫度80 ℃;提取時(shí)間選取1、3、5、7 h 和9 h 五個(gè)水平，其他參數(shù)為:料液比1∶30(g/mL)，提取溫度80 ℃;提取溫度選取40、50、60、70、80 ℃和90 ℃六個(gè)水平，其他參數(shù)為:料液比1∶30(g/mL)，提取時(shí)間5 h。

2.4 熱水法提取黃參多糖的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在熱水法提取黃參多糖單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，確定了提取時(shí)間、提取溫度及液料比的最佳工藝參數(shù)，以多糖得率為指標(biāo)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素、水平及編碼Table 1 Experiment factors，levels and code

2.5 黃參多糖的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.5.1 黃參多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的VC和黃參多糖，充分溶解后配制濃度為5.0 mg/mL 的母液，再稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02 mg/mL，取1 mL不同質(zhì)量濃度(0.02～2 mg/mL)的多糖溶液、2 mL DPPH 溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)、2 mL 甲醇溶液充分混合均勻后在黑暗中靜置30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光值［10］。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品重復(fù)三次，求平均值。DPPH 自由基清除率公式如下:

式中:A0表示無(wú)樣品的DPPH 溶液的吸光值;Ai表示待測(cè)樣與DPPH 混合溶液的吸光值;Aj表示不加DPPH 的樣品的吸光值。

2.5.2 黃參多糖對(duì)·OH 自由基的清除作用

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的VC和黃參多糖，充分溶解后配制濃度為5.0 mg/mL 的母液，再稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02 mg/mL，將2 mL多糖溶液、2 mL 6 mmol/L 的FeSO4溶液、H2O2溶液混勻后靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L 的水楊酸溶液，混勻，靜置30 min 后，在510 nm 處測(cè)定吸光值［11］。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)樣品重復(fù)三次，求平均值。·OH 清除率計(jì)算公式如下:

式中:A0表示無(wú)樣品的混合反應(yīng)液的吸光值;Ai表示待測(cè)樣與混合反應(yīng)液的吸光值;Aj表示不加水楊酸的樣品溶液的吸光值。

PMS/ NADH 體系會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，用NBT 顯色法測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的VC和黃參多糖，充分溶解后配制濃度為5.0 mg/mL 的母液，再稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02 mg/mL，反應(yīng)混合物中依次加入不同濃度的多糖溶液，Tris-HCl (16 mmol/L，pH 8.0)，NADH (557 μmol/L)，NBT(108 μmol/L)和PMS(45 μmol/L)，在25 ℃溫浴5 min，在560 nm 下測(cè)吸光值［12］。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)樣品重復(fù)三次，求平均值。清除率公式如下:

式中:A0表示無(wú)樣品的混合反應(yīng)液的吸光值;Ai表示待測(cè)樣與混合反應(yīng)液的吸光值。

2.5.4 還原力的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的黃參多糖和VC，充分溶解后配制濃度為5.0 mg/mL 的母液，再稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02 mg/mL。不同濃度的多糖溶液(0.02～2 mg/mL)1 mL、2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH=6.6)、鐵氰化鉀［K3Fe(CN)6］溶液(1%)2.5 mL 混合均勻，50 ℃水浴20 min。加入10%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。在700 nm 下測(cè)吸光值［13］。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，吸光值越高還原力越強(qiáng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 常規(guī)熱水提取法提取黃參多糖

3.1.1 單因素結(jié)果與分析

3.1.1.1 提取次數(shù)對(duì)黃參多糖得率的影響

由圖1a 得知，隨著提取次數(shù)的增加，黃參多糖的得率呈現(xiàn)迅速增加的趨勢(shì)，在提取次數(shù)達(dá)到3 次以上時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加多糖得率增幅緩慢，為了節(jié)約資源，簡(jiǎn)化操作，確定次數(shù)為3 次。

3.1.1.2 提取時(shí)間對(duì)黃參多糖得率的影響

由圖1(b)得知，在一定范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃參多糖的得率先增大后減小，在提取時(shí)間為5 h 時(shí)，多糖得率最高。這是因?yàn)樘幚頃r(shí)間太短，原料中的多糖溶解不充分;而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使多糖降解為單糖、寡糖或低聚糖，導(dǎo)致得率的下降［8］。因此，提取時(shí)間應(yīng)確定為5 h。

3.1.1.3 提取溫度對(duì)黃參多糖得率的影響

由圖1(c)可知，提取溫度對(duì)黃參多糖得率的影響顯著，隨著提取溫度的升高，多糖得率顯著提高，在70 ℃時(shí)最高，溫度過(guò)高時(shí)，溶液中的多糖會(huì)有損失，所以溫度在達(dá)到一定水平后，多糖得率逐漸降低，而且溫度過(guò)高可能會(huì)造成多糖活性的喪失。因此，確定提取溫度為70 ℃。

3.1.1.4 料液比對(duì)黃參多糖的率的影響

由圖1(d)可知，料液比對(duì)多糖得率的影響較為顯著，隨著料液比的增大多糖的得率逐漸增加，在料液比為1∶30(g/mL)時(shí)得率最高，隨后隨著料液比的增大多糖得率逐漸降低。這可能是因?yàn)榱弦罕刃。崛◇w系中含水量少，原料中的多糖不能充分溶出，料液比太大，濃縮時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致多糖損失［14］，得率降低。因此，因選擇料液比為1∶30(g/mL)。

3.1.2 響應(yīng)面法優(yōu)化熱水提取黃參多糖的工藝研究

圖1 提取次數(shù)(a)、提取時(shí)間(b)、溫度(c)及料液比(d)對(duì)多糖得率的影響Fig.1 The effect of times of extraction (a)，extraction duration(b)，extraction temperature(c)and solid/liquid ratio (d)on the yield of polysaccharide

以黃參多糖得率為響應(yīng)值Y，通過(guò)SAS 軟件對(duì)試驗(yàn)資料進(jìn)行響應(yīng)面分析，共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5 個(gè)為零點(diǎn)，析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn);零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，其中零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5 次，用以估算試驗(yàn)誤差［15］。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，經(jīng)二次回歸擬合后求得響應(yīng)函數(shù)，得到的回歸方程如下:

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 RSM design matrix and the responses

表3 多糖得率回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression coefficient and ANOVA test of the yield of polysaccharide

方差分析見(jiàn)表3。模型誤差顯著，失擬誤差不顯著，回歸系數(shù)R2為0.991，說(shuō)明模型的擬合度很好，響應(yīng)值的99.1%的是由于所選變量引起的，決定系數(shù)(R2adj=0.9795)接近于1，變異系數(shù)(C.V.=3.87%)很低，都說(shuō)明模型相關(guān)性高，用該模型模擬真實(shí)的三因素三水平的分析是可行的［16］。可以用該模型方程來(lái)分析和預(yù)測(cè)不同提取條件下黃參多糖的得率的變化。

由表3 的結(jié)果可以看出三個(gè)因素對(duì)多糖得率影響的主次是X2＞X1＞X3，一次項(xiàng)XI、X2、X3，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)XIX2、XIX3都是極顯著的，表明各因素不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，且對(duì)響應(yīng)值的影響有明顯的交互作用。

從響應(yīng)面分析圖2(a)、(b)和(c)中可以看出響應(yīng)值與影響因素的關(guān)系:提取溫度對(duì)黃參多糖提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線(xiàn)較陡，其次依次為提取時(shí)間和料液比，表現(xiàn)為曲線(xiàn)較平緩。

3.1.3 優(yōu)化提取參數(shù)

根據(jù)所得模型由SAS 軟件分析得到黃參多糖熱水提取的最佳條件為:提取時(shí)間為5.44 h，溫度為74.79 ℃，料液比為1∶34.19(g/mL)，理論最佳提取率為12.61%。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳提取條件進(jìn)行黃參多糖熱水提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作和生產(chǎn)的便利，因此將熱水提取黃參多糖的各個(gè)實(shí)驗(yàn)因素條件修訂為:時(shí)間5.45 h，溫度為75 ℃，料液比為1∶34(g/mL)。經(jīng)過(guò)5 次平行實(shí)驗(yàn)，得到的平均得率為12.52%。提取率與預(yù)測(cè)結(jié)果契合度高，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可行，適合黃參多糖的提取。

3.2 黃參多糖的體外抗氧化活性

3.2.1 黃參多糖對(duì)DPPH·自由基的清除作用

DPPH·自由基被認(rèn)為一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物可以清除它，則表明受試物具有抗氧化活性。DPPH·有個(gè)單電子，在517 nm 有最大吸收，其甲醇溶液呈深紫色，加入有抗氧化活性的受試物后能與DPPH·的單電子配對(duì)，從而使得DPPH·的濃度減小顏色變淺，光吸收值減小［17］。黃參多糖對(duì)DPPH·自由基的清除作用見(jiàn)圖3(a)。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，黃參多糖對(duì)DPPH·自由基有一定的清除作用，隨著濃度的升高，清除作用也逐漸加強(qiáng)，當(dāng)黃參多糖濃度為2 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH·自由基的清除率可達(dá)到63%。

圖2 提取時(shí)間和料液比(a)、料液比和提取溫度(b)及提取溫度和提取時(shí)間(c)對(duì)黃參多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.2 Response surface plots and contour plots showing the effects of extraction duration and solid/liquid ratio (a)，solid/liquid ratio and extraction temperature (b)and extraction duration and extraction temperature (c)on extraction yield of S.gracilis polysaccharide

3.2.2 黃參多糖對(duì)·OH 自由基的清除作用

·OH 是一種活性氧自由基，毒性極強(qiáng)，可造成生物膜損傷，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，物理輻射等因素都會(huì)促進(jìn)其形成［18］。黃參多糖對(duì)·OH 自由基的清除作用與黃參多糖的濃度成正相關(guān)，見(jiàn)圖3(b)，當(dāng)黃參多糖濃度為2 mg/mL 時(shí)，對(duì)·OH 自由基的清除率可達(dá)72.3%。

3.2.3 黃參多糖對(duì)超氧自由基的清除作用

超氧陰離子自由基是人體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，加快肌體的衰老，誘發(fā)癌癥、心血管疾病，嚴(yán)重危害人體健康［19］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃參多糖對(duì)超氧自由基有一定的清除作用，如圖3(c)所示，隨著黃參多糖濃度的增加，清除作用逐漸增強(qiáng)，多糖濃度為5 mg/mL 時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基的清除為78.2%。

3.2.4 還原力

圖3 黃參多糖與Vc 對(duì)DPPH·自由基(a)、·OH 自由基(b)及超氧自由基(c)的清除能力及還原力(d)比較Fig.3 Comparison of DPPH radical scavenging ability (a)，hydroxyl radical scavenging ability (b)，super radical scavenging ability(c)and reducing power (d)of S.gracilis polysaccharide and Vc

抗氧化劑是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)［20］。因此，可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明其抗氧化活性的大小。從圖3(d)可以看出，與VC相比，黃參多糖的還原力很弱，隨著黃參多糖濃度的增加，其總還原力呈緩慢增大，總體上呈現(xiàn)出一定的濃度依賴(lài)性。

4 討論與結(jié)論

多糖又稱(chēng)多聚糖，是機(jī)體內(nèi)一類(lèi)重要的生物活性物質(zhì)，由一種或多種單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成，廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌等有機(jī)體中，與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸一起被視為生物體中最重要的4 種生物大分子物質(zhì)［21］。現(xiàn)代研究證明多糖有多種生物活性和功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、抗凝血、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等。丁春邦等用熱水法、微波法和酶法從淫羊藿中提取多糖并對(duì)幾種方法得到的多糖的抗氧化活性做了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明熱水法得到的多糖抗氧化活性最高。陳群和劉家昌［22］在對(duì)人參多糖、黃芪多糖和枸杞多糖的研究中發(fā)現(xiàn)，人參多糖、黃芪多糖和枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性和抗衰老作用;人參多糖、黃芪多糖還具有抗腫瘤作用［23］。

本文利用常規(guī)熱水提取法提取黃參多糖，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化得到了其提取工藝的最佳工藝參數(shù);常規(guī)熱水提取法提取黃參多糖的提取方法提取工藝條件為:時(shí)間5.45 h，溫度為75 ℃，料液比為1∶34(g/mL)，多糖得率為12.52%。該方法省時(shí)、環(huán)保，多糖得率高，適合黃參多糖的提取。與其它提取工藝相比，該方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單有效，在一般實(shí)驗(yàn)室條件下都能夠?qū)崿F(xiàn)，能夠被廣泛應(yīng)用，而且提取多糖的得率較高。并且，通過(guò)考察黃參多糖對(duì)和自由基的清除能力以及對(duì)亞鐵離子螯合作用和還原力的作用，結(jié)果表明，黃參多糖具有良好的抗氧化活性，為對(duì)其深入研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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