鹽酸催化水解槐角異黃酮的研究

張曉松，張博雅，金 花，張永忠

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，哈爾濱 150030

槐角具有消熱清火、涼血止血的保健和藥理活性，是我國(guó)著名的傳統(tǒng)中草藥，可用于治療緩解頭痛、止血和治療血管性高血壓等疾病。近些年來(lái)，人們對(duì)槐角的天然活性物質(zhì)進(jìn)行了提取和研究發(fā)現(xiàn)，槐角中含有大量的異黃酮類(lèi)物質(zhì)，包括染料木苷(genistin)、槐角苷(Sopho-ricoside)、槐角雙苷(Sophorabioside)、染料木黃酮-7-雙葡萄糖苷(genistein-7-diglucoside)和染料木黃酮-7，4-雙葡萄糖苷(genistein-7，4-diglucoside)等［1-4］。槐角中總異黃酮的含量高達(dá)200 g/kg［5］以上，遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)異黃酮提取物大豆的525～986 mg/kg［6］。同時(shí)，槐角異黃酮的提取和純化成本都較大豆要低，因此對(duì)于槐角異黃酮的研究吸引了許多科學(xué)工作者的目光［7，8］。

槐角中異黃酮主要包含糖苷型和苷元型兩種存在形式，其中苷元型的染料木黃酮功能活性最高，也是國(guó)際公認(rèn)的抗氧化、抗癌化合物，能夠有效地起到預(yù)防和抑制中老年骨質(zhì)疏松、乳腺癌、前列腺癌以及婦女更年期綜合癥等疾病的作用［9-11］，但其在槐角中的含量較少。在大豆異黃酮的研究中，高活性的苷元型異黃酮經(jīng)常通過(guò)糖苷型異黃酮水解制備，其中最常用的就是酸水解法，如:高榮海等利用鹽酸水解大豆異黃酮制備苷元型產(chǎn)物［12］，水解率可達(dá)81.31%;蔣磊等則采用超聲波輔助酸法水解糖苷型大豆異黃酮，且確定了最佳水解條件［13］。因此本實(shí)驗(yàn)以提高槐角異黃酮中染料木黃酮含量為目的，利用酸解法水解槐角苷、槐屬雙苷等糖苷型化合物，使其糖苷鍵斷裂最終獲得苷元型染料木黃酮，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)水解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期通過(guò)該研究對(duì)藥用植物槐角的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用起到積極推動(dòng)作用。

1 儀器與材料

HZS-H 水浴振蕩器，哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠(chǎng);Agilent-1100 高效液相色譜儀(HPLC)，配Agilent-G1314A 泵，Agilent-G1314A 紫外檢測(cè)器，色譜柱C18柱(4.6 ×150 mm，5 μm);梅特勒-電子天平AL104型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

槐角異黃酮粉，參考文獻(xiàn)［14］自制(總異黃酮含量46.5%);染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(貨號(hào)G6649，98%)，Sigma 公司;甲醇(色譜純)和水(超純水);其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HPLC 測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件

流動(dòng)相體積比:甲醇∶水=55 ∶45;流速:1.00 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm;檢測(cè)時(shí)間:15 min。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品0.0250 g，用甲醇(色譜純)定容至100.0 mL 容量瓶中，制成染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液，甲醇定容為25.00 mL，配制系列梯度濃度(0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11、0.13、0.15、0.17 mg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)。利用HPLC 進(jìn)行測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.2 鹽酸水解反應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鹽酸對(duì)槐角中的糖苷型異黃酮進(jìn)行水解，制備苷元型產(chǎn)物染料木黃酮，其化學(xué)反應(yīng)方程式及實(shí)驗(yàn)操作如下:

圖1 槐角異黃酮水解化學(xué)反應(yīng)方程式Fig.1 Hydrolysis routes of Fructus Sophorae isoflavones

利用水和正丁醇混合溶液(體積比為:水∶正丁醇=1∶2)，萃取槐角異黃酮粉3 次。萃取后的正丁醇相經(jīng)減壓脫溶、離心干燥后，得到異黃酮萃取物。精密稱(chēng)取此萃取物0.0100 g，以色譜純甲醇溶液溶解，稀釋并定容至50.00 mL。另取一份萃取物0.0100 g，然后與20 mL 一定濃度的鹽酸甲醇溶液混合，將此溶液轉(zhuǎn)移至水浴振蕩器內(nèi)，于一定溫度下水解一定時(shí)間，反應(yīng)冷卻后用NaOH 溶液(1.0 mol/L)調(diào)pH 至7，然后將水解液用甲醇定容至50.00 mL。應(yīng)用高效液相色譜測(cè)定水解前后染料木黃酮的含量。槐角異黃酮水解率計(jì)算公式如下:

式中，以完全水解確定水解后產(chǎn)物中染料木黃酮含量。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法，調(diào)節(jié)鹽酸濃度為2.5 mol/L，水解3.5 h。不斷增加水解溫度，直至染料木黃酮含量不再升高為止。

2.3 鹽酸水解單因素試驗(yàn)

以槐角異黃酮水解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)水解時(shí)間、鹽酸濃度和水解溫度3 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)平行三次，取平均值。單因素試驗(yàn)條件范圍如下:設(shè)定水解溫度為60 ℃，鹽酸濃度為2 mol/L，分別使水解時(shí)間為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h 進(jìn)行水解;設(shè)定水解溫度為60 ℃，水解時(shí)間3.5 h，配制濃度為1、1.5、2、2.5、3、3.5 mol/L 的鹽酸溶液進(jìn)行水解;設(shè)定鹽酸濃度為2 mol/L，水解時(shí)間3.5 h，分別在溫度為40、50、60、70、80、90 ℃條件下進(jìn)行水解。根據(jù)單因素所確定的水解實(shí)驗(yàn)條件，通過(guò)測(cè)定槐角異黃酮水解率來(lái)確定最佳水解時(shí)間，鹽酸濃度及最佳水解溫度。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

由單因素分析后，選擇水解時(shí)間，鹽酸濃度和水解溫度3 個(gè)因素，使用Box-Behnken 中心組合進(jìn)行3因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)［15］，因素水平表見(jiàn)表1。并通過(guò)Design-Expert V8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken Design

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC 法測(cè)定染料木黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

測(cè)定系列濃度的染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，染料木黃酮質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，得回歸方程:Y=5760.8X-2.0476，R2=0.9994。

3.2 單因素試驗(yàn)

圖2 水解時(shí)間(a)、鹽酸濃度(b)及水解溫度(c)對(duì)槐角異黃酮水解率的影響Fig.2 Effects of hydrolysis time (a)，hydrochloric acid concentration (b)and hydrolysis temperature (c)on the hydrolysis rate of isoflavones

3.2.1 水解時(shí)間對(duì)異黃酮水解率的影響

如圖2a 可知，在水解時(shí)間為3.5 h 之前，水解率隨著水解時(shí)間的增加而快速提升。當(dāng)水解時(shí)間為3.5 h 時(shí)，水解率最高。但是，繼續(xù)延長(zhǎng)水解時(shí)間卻發(fā)現(xiàn)異黃酮的水解率呈下降趨勢(shì)。分析造成這種現(xiàn)象的原因，可能是隨著反應(yīng)的進(jìn)行，水解產(chǎn)物的含量雖然提高，卻越來(lái)越不穩(wěn)定，易被氧化而導(dǎo)致水解率下降。

3.2.2 鹽酸濃度對(duì)異黃酮水解率的影響

由圖2b 可以看出，在鹽酸濃度2.5 mol/L 以前，水解率隨鹽酸濃度的升高而快速提高。當(dāng)鹽酸濃度為2.5 mol/L 時(shí)，水解率最高。而后繼續(xù)增加鹽酸濃度卻發(fā)現(xiàn)異黃酮水解率呈下降趨勢(shì)。這因?yàn)樵邴}酸濃度較低時(shí)，增加鹽酸濃度可以促進(jìn)水解，而當(dāng)水解達(dá)到頂峰時(shí)，過(guò)大的鹽酸濃度可能會(huì)破壞染料木黃酮。

3.2.3 水解溫度對(duì)異黃酮水解率的影響

由圖2c 所示，70 ℃之前隨著水解溫度的升高，水解率上升明顯。當(dāng)水解溫度為80 ℃時(shí)，槐角異黃酮的水解率最大。這是由于溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)速度越快，水解率上升越明顯。當(dāng)水解溫度高于80 ℃時(shí)，水解率變化不明顯。因此，選擇水解溫度80 ℃為最佳反應(yīng)溫度，既能獲得較高水解率，也避免了能源的浪費(fèi)。

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

3.3.1 多元二次模型方程的建立與檢驗(yàn)

采用Design-Expert 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化的17 組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以水解時(shí)間，鹽酸濃度和水解溫度為自變量，以槐角異黃酮水解率為響應(yīng)值Y 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

使用Design-Expert 軟件對(duì)表2 進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到多元二次響應(yīng)面回歸模型，回歸方程為:

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

從表3 可以看出，回歸模型達(dá)到極顯著水平(P＜0.0001)，失擬誤差(P=0.1962 ＞0.05)不顯著，說(shuō)明該回歸方程的建立與實(shí)際情況互相吻合，同時(shí)決定系數(shù)與矯正決定系數(shù)可以解釋響應(yīng)值的變化，因此可以利用該回歸方程確定水解的最佳工藝條件。方差分析中一次項(xiàng)X1(水解時(shí)間)、X2(鹽酸濃度)、X3(水解溫度)對(duì)模型影響極其顯著，交互項(xiàng)X1X2影響顯著;二次項(xiàng)和對(duì)模型影響極顯著。該模型的確定系數(shù)值為0.9739，說(shuō)明響應(yīng)面變化有97.39%來(lái)自水解時(shí)間，鹽酸濃度及水解溫度。因此，根據(jù)方差分析結(jié)果，可知各因素影響順序:X2(鹽酸濃度)＞X1(水解時(shí)間)＞X3(水解溫度)。

3.3.2 響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖分析

利用Design-Expert 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，做出二次回歸方程響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖，從立體圖3 可知，鹽酸濃度與水解時(shí)間，水解溫度與水解時(shí)間，鹽酸濃度與水解溫度之間的交互作用對(duì)異黃酮水解率的影響。利用該組圖，可分析任何兩因素對(duì)異黃酮水解率的交互影響，并確定最優(yōu)工藝。

圖3 水解時(shí)間和鹽酸濃度(a-b)、水解時(shí)間和水解溫度(c-d)及水解溫度和鹽酸濃度(e-f)交互作用對(duì)異黃酮水解率的影響和等高線(xiàn)圖Fig.3 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of hydrolysis time and hydrochloric acid concentration (a-b)，hydrolysis time and hydrolysis temperature (c-d)and hydrolysis temperature and hydrochloric acid concentration(e-f)on the hydrolysis rate of isoflavones

由組圖3 可以看出，等高線(xiàn)圖越趨近圓形，模型中各因素交互作用越弱，因此水解時(shí)間與鹽酸濃度的交互作用對(duì)異黃酮水解率的影響最大，與方差分析結(jié)果一致。根據(jù)回歸方程，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，當(dāng)響應(yīng)值最大時(shí)，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)為:水解時(shí)間3.8 h、鹽酸濃度2.59 mol/L、水解溫度78.5℃。預(yù)測(cè)最佳水解率為93.83%。

3.3.3 最佳條件驗(yàn)證試驗(yàn)

將水解時(shí)間設(shè)定為3.8 h、鹽酸濃度2.59 mol/L、水解溫度78.5 ℃時(shí)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，實(shí)際測(cè)得異黃酮水解率平均值為93.38%。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相互吻合，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好，驗(yàn)證了所建模型的正確性。說(shuō)明響應(yīng)面法適用于對(duì)槐角異黃酮的水解條件進(jìn)行回歸分析和工藝優(yōu)化。

4 結(jié)論

應(yīng)用鹽酸催化可對(duì)槐角總異黃酮進(jìn)行水解，得到染料木黃酮。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，利用Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立了槐角異黃酮水解率的回歸方程。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸濃度，水解時(shí)間和水解溫度對(duì)異黃酮水解率影響極顯著。最佳工藝條件為:水解時(shí)間3.8 h、鹽酸濃度2.59 mol/L、水解溫度78.5 ℃。在此條件下測(cè)得槐角總異黃酮的水解率為93.38%，與預(yù)測(cè)值吻合。本文首次對(duì)槐角中糖苷型異黃酮進(jìn)行鹽酸催化轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生生物利用度更高的染料木黃酮。染料木黃酮可以和中藥的有效成分發(fā)生配合，達(dá)到提高藥效和預(yù)防保健功能的目的。

1 Do TH，Trinh NT，Tran TP，et al.The selected flavonol glycoside derived from Sophorae Flos improves glucose uptake and inhibits adipocyte differentiation via activation AMPK in 3T3-L1 cells.Bioorgan Med Chem Lett，2010，20:6076-6081.

2 Chang L，Ren YP，Cao L，et al.Simultaneous determination and pharmacokinetic study of six flavonoids from Fructus Sophorae extract in rat plasma by LC-MS/MS.J Chromatogr B，2012，904:59-64.

3 Li YM，Zhong H，Lu YQ.Comparative study on rare earth elements from Flos Sophorae and Fructus Sophorae.J Rare Earths，2012，30:397-400.

4 Xu Q，Shen YY，Wang HF，et al.Application of response surface methodology to optimise extraction of flavonoids from fructus sophorae.Food Chem，2013，138:2122-2129.

5 Cong YB(叢艷波)，Zhang YZ(張永忠)，Liu X(劉瀟).Study on total isoflavones from Fructus Sophorae by subcritical water extraction.Chin Tradit Herb Drugs(中 草 藥)，2010，41:717-720.

6 Akitha Devi MK，Gondi M，Sakthivelu GP，et al.Functional attributes of soybean seeds and products，with reference to isoflavone content and antioxidant activity.Food Chem，2009，114:771-776.

7 Wang JB(王劍波)，Guo P(郭萍)，Zhao XB(趙小兵)，et al.Determination of genistein in Fructus Sophorae extract by RP-HPLC.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2004，35:402-403.

8 Du PP(都盼盼)，Shi YB(石延榜)，Zhang ZL(張振凌)，et al.Effects of different processing methods on content of flavonoids fromSophorae Fructus.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2014，45:3271-3274.

9 Wang JH (王建華)，Li E (李恩)，Kong DJ (孔德娟)，et al.Effects of isoflavones on bone mineral density and bone metabolism in ovariectomized rats.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2003，15:43-45.

10 Tsao R，Papadopoulos Y，Yang R，et al.Isoflavone profiles of red clovers and their distribution in different parts harvested at different growing stages.J Agric Food Chem，2006，54:5797-5805.

11 Corinna ER，Sabine EK.Antioxidant activity of isoflavones and their major metabolites using differentin vitroassays.J Agric Food Chem，2006，54:2926-2931.

12 Gao RH(高榮海)，Li CB(李長(zhǎng)彪)，Meng XW(孟憲文)，et al.Hydrolysis of soybean isoflavone glycoside.China Oil(中國(guó)油脂)，2007，32(5):52-55.

13 Jiang L(蔣磊)，Yu GP(于國(guó)萍)，Dai W(代微).Ultrasonic assisted acid hydrolysis of soy isoflavones.Food Ind Technol(食品工業(yè)科技)，2007，28(9):165-168.

14 Zhang BY(張博雅)，Zhou L(周麗)，Wang FR(王鳳榮)，et al.Study on extraction of total isoflavones fromSophorae Fructusby pressurized solvent.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2012，43:1108-1111.

15 Jin HL，Myoung GC.Determination of optimal acid hydrolysis time of soybean isoflavones using drying oven and microwave assisted methods.Food Chem，2011，129:577-582.