組培霍山石斛、野生霍山石斛及河南石斛多糖及乙醇溶出物動(dòng)態(tài)積累規(guī)律研究

陳乃東，陳乃富，王陶陶，顧 鎮(zhèn)

1皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院;2 皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，六安 237012;3安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

霍山石斛(Dendrobium huoshanenseTang et Cheng)屬蘭科石斛屬多年生草本植物，主產(chǎn)于安徽霍山縣，具養(yǎng)胃生津、滋陰清熱、明目等功效［1］，是安徽道地藥材之一，由于自然狀態(tài)下萌芽率低、生長(zhǎng)緩慢，加上長(zhǎng)期過(guò)度采挖，資源瀕危［2-5］。在霍山石斛的道地產(chǎn)區(qū)，采用組培快繁快速獲得試管苗或人工誘導(dǎo)種子萌發(fā)產(chǎn)生實(shí)生苗大規(guī)模野外栽培的組培霍山石斛，已逐漸替代野生資源成為藥用霍山石斛的主要來(lái)源［2-5］。多糖和乙醇溶出物是石斛類(lèi)中藥發(fā)揮藥理作用的主要成分［6-8］，在2010 版《中國(guó)藥典》就以多糖含量和乙醇溶出物含量作為判斷鐵皮石斛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［9-12］，因此，研究組培霍山石斛、野生霍山石斛多糖及乙醇溶出物的積累與株齡的關(guān)系，對(duì)于霍山石斛的規(guī)范化栽培和采收具有重要意義。實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)當(dāng)前藥材市場(chǎng)中霍山石斛的主要偽品——河南石斛(Dendrobium henanenseJ.L.Lu et L.X Gao)的多糖及醇溶物的動(dòng)態(tài)積累進(jìn)行了對(duì)比研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

TU-1901 雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);KQ-5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-S6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng));GL-200-Ⅱ型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));GL-20G-Ⅱ電子分析天平(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));202A-3型數(shù)顯電熱干燥箱(上海錦屏儀器儀表有限公司)。葡萄糖對(duì)照品(SIGMA 試劑公司);其他所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 供試樣品

供試藥材野生霍山石斛、河南石斛采于安徽省霍山縣，組培霍山石斛由安徽省霍山縣億康生物科技有限公司提供，品種和株齡經(jīng)安徽省省級(jí)2011 協(xié)同創(chuàng)新中心——霍山石斛產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心主任陳乃富教授鑒定為1～4年株齡組培霍山石斛(tissue-culturedDendrobium huoshanense)、1～4年株齡野生霍山石斛(wildDendrobium huoshanense)、1～4年株齡河南石斛(Dendrobium henanense)。采集的樣品莖葉分離，莖80 ℃烘至恒重，粉碎，過(guò)60 目篩，干燥器儲(chǔ)存待用。供試樣品采集信息見(jiàn)表1。

表1 供試樣品采集信息Table 1 Information of the samples used in the experiments

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 乙醇浸出物及總多糖提取液的制備

精密稱(chēng)取干燥至恒重的供試樣品粉末1.0 g 以95%乙醇(g∶mL，1∶25)85 ℃回流提取1 h，重復(fù)三次，過(guò)濾，合并濾液，得乙醇總浸出物溶液，加95%乙醇定容至75 mL，備用。

濾渣于90 ℃熱水(g∶mL，1∶100)浸提2 h，重復(fù)提取3 次，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至100 mL，4℃的冰箱冷卻1 h，5000 rpm 離心15 min，收集上清液，得總多糖提取液，定容至100 mL，備用。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。

2.2 多糖的含量測(cè)定

精密吸取1.0 mL 步驟2.1 中制備的總多糖提取液，置于10 mL 具塞刻度試管，在冰水浴中緩緩精密加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，搖勻，冷卻后置沸水浴中保溫10 min 后取出，冰水浴中冷卻10 min，于621 nm 下測(cè)吸光度值(A)。以葡萄糖為對(duì)照品制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):精密稱(chēng)取105 ℃干燥恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖以蒸餾水配制0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 和1.0 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞刻度試管中，分別加水定容至1.0 mL，搖勻，在冰水浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，搖勻，冷卻后管口加蓋，置沸水浴中保溫10.0 min 后取出，冰水浴中冷卻10.0 min，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL 管為空白，于621 nm 下測(cè)吸光度值，得回歸方程A=9.366C+0.101，R2=0.995，A 為吸光度，C 為濃度。計(jì)算出各供試樣品以葡萄糖計(jì)的多糖含量。

精密量取步驟2.1 中制備的總多糖提取液90 mL，緩緩加入無(wú)水乙醇至乙醇的濃度為76%，4 ℃冰箱中保存24 h 后5000 rpm 離心15 min，沉淀依次用乙醇，丙酮和乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，溶解在適量蒸餾水，按Sevag 法脫蛋白，冷凍干燥，得精制多糖，精密稱(chēng)取精制多糖10.0 mg，置l00 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，精密吸取1.0 mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)定其吸光度，按下式計(jì)算換算因子(F):

其中:W:精制多糖質(zhì)量(mg);C:多糖液中葡萄糖折合濃度(mg/mL);D:稀釋倍數(shù)。

測(cè)得葡萄糖對(duì)各供試樣品多糖的換算因子(表2)。各樣品以葡萄糖計(jì)多糖含量乘以葡萄糖對(duì)供試樣品多糖的換算因子，計(jì)算出供試樣品中多糖含量。

表2 葡萄糖對(duì)各供試樣品多糖的換算因子Table 2 The conversion factor of glucose to polysaccharides from different ages of tissue-cultured and wild D.huoshanese as well as D.henanense

2.3 醇溶性浸出物含量測(cè)定方法

精密量取制備的各供試樣品乙醇浸出液25 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱(chēng)重，計(jì)算供試品中乙醇浸出物含量。重復(fù)3次。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS17.0 對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 多糖積累規(guī)律

多糖作為能量物質(zhì)同時(shí)參與植物營(yíng)養(yǎng)貯藏與代謝，多糖的累積與藥用植物的生長(zhǎng)是一個(gè)互相交替的過(guò)程，生長(zhǎng)年限對(duì)多糖的累積有較大的影響。組培霍山石斛、野生霍山石斛、河南石斛多糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析結(jié)果表明，不同株齡的組培霍山石斛、野生霍山石斛和河南石斛多糖含量測(cè)定結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)。三種石斛多糖含量與生長(zhǎng)年限密切相關(guān)，株齡2年的植株多糖含量最高，株齡4年的多糖含量最低，這與三種石斛樣品的生理特性有關(guān):株齡1年的植株，莖葉均生長(zhǎng)旺盛，莖、葉中的葉綠體均可進(jìn)行光合作用，多糖積累的速度快，二年生的植株基本只能保留少量老葉，主要依賴(lài)莖中的葉綠體進(jìn)行光合作用，仍有多糖積累，但積累速度下降，3～4年植株，完全無(wú)葉，莖逐漸老化，葉綠體減少，多糖的積累不足以維持植株維持生命活動(dòng)的能量需要，需消耗前期合成的多糖維系生命活動(dòng)。株齡相同的組培霍山石斛、野生霍山石斛和河南石斛多糖含量存在顯著差異，多糖的含量從大到小依次為:組培霍山石斛＞野生霍山石斛＞河南石斛，如以多糖含量作為標(biāo)準(zhǔn)，株齡2年的組培霍山石斛品質(zhì)較好。

3.2 醇溶性浸出物累積規(guī)律

供試的3 種石斛醇溶性浸出物含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)測(cè)定的12 種石斛樣品乙醇浸出物含量測(cè)定結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)。栽培1～3年，三種石斛醇溶性浸出物含量均隨著生長(zhǎng)期延長(zhǎng)而增加，第4年出現(xiàn)下降，因此，從乙醇浸出物含量角度，三種石斛均以3年采收為宜。相同株齡的組培霍山石斛、野生霍山石斛及河南石斛，野生霍山石斛醇浸出物量較高，但三者之間差別不明顯。

3.3 多糖和乙醇浸出物總量積累規(guī)律

三種石斛樣品多糖和乙醇浸出物總量與生長(zhǎng)年限緊密相關(guān)(表3)，隨著生長(zhǎng)周期的增加多糖和乙醇浸出物總量先增加后下降，組培霍山石斛在栽培第二年，多糖與醇浸出物總量達(dá)到最大，2年后多糖和醇溶性物質(zhì)總量逐年下降，而野生米斛和河南石斛多糖與醇溶性組分總量在第三年達(dá)到峰值。組培霍山石斛與野生霍山石斛多糖與醇溶性組分總量差異不顯著，二者與河南石斛差別較為明顯。

表3 不同株齡的組培霍山石斛、野生霍山石斛及河南石斛多糖和乙醇浸出物的積累規(guī)律(%，Mean±SD)Table 3 Accumulation of polysaccharides and ethanol-soluble extract in tissue-cultured and wild D.huoshanense and D.henanense(%，Mean±SD)

4 結(jié)論與討論

組培霍山石斛、野生霍山石斛與河南石斛多糖與醇溶性浸出物含量與生長(zhǎng)年限密切相關(guān)。不同品種間多糖、浸出物含量存在顯著差異，但動(dòng)態(tài)變化規(guī)律基本一致。根據(jù)多糖與浸出物含量的動(dòng)態(tài)變化，如以多糖含量為采收目標(biāo)，組培霍山石斛、野生霍山與河南石斛栽培2年采收為宜，如以乙醇浸出物含量為標(biāo)準(zhǔn)，三者均以生長(zhǎng)三年的藥材品質(zhì)為佳，這與傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為三年株齡的霍山石斛品質(zhì)最佳相一致。作為霍山石斛的主要偽品——河南石斛，從多糖含量到多糖與乙醇溶出物總量，明顯低于霍山石斛，因此，從多糖和以醇浸提物含量的角度考慮，河南石斛的藥材品質(zhì)可能低于霍山石斛。

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