不同采收期玄參中核苷類成分的含量分析

王勝男 ，華愉教，鄒立思，羅益遠(yuǎn)，劉訓(xùn)紅*，劉娟秀，嚴(yán) 穎，徐 力

1南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023;2 揚(yáng)州市藥品檢驗所，揚(yáng)州 225000

玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根，是一味大宗常用中藥材。具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)的功效［1］。現(xiàn)代研究表明，玄參具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗炎、增強(qiáng)免疫等藥理活性［2-4］，其藥效成分除了環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷類及有機(jī)酸類成分之外，核苷類成分對藥效發(fā)揮的協(xié)同作用也不能忽視［2-5］。近年來研究證實核苷類成分具有廣泛的生理活性，如改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放等作用［5-9］。玄參滋陰藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，但陰虛患者常表現(xiàn)為免疫功能低下［5］，因此，鑒于核苷免疫調(diào)節(jié)作用，可以推斷其為玄參滋陰的功效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

目前，關(guān)于玄參藥材的質(zhì)量評價及采收期考察，多以環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷類及有機(jī)酸類成分為主要指標(biāo)［10，11］，尚未見核苷類成分的研究報道。本實驗以道地產(chǎn)區(qū)浙江磐安玄參為研究對象，基于超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿/線性離子阱質(zhì)譜(UPLCQTRAP-MS/MS)技術(shù)，建立同時測定玄參中10 種核苷類成分含量的方法，分析不同采收期玄參中核苷類成分積累的動態(tài)變化，為深入探討玄參藥材的品質(zhì)形成機(jī)制及確定其藥材適宜采收期提供基礎(chǔ)資料，同時為玄參藥材質(zhì)量的綜合評價提供新的方法參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津液相UPLC-20ADXR 系列(日本Shimadzu公司)，配有溶劑脫氣裝置、自動進(jìn)樣器;API 4000四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX 公司)，配有離子噴霧接口;KQ-500B 超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 kHz);BSA2245 型電子分析天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司);ME36S 型電子分析天平(百萬分之一，德國賽多利斯公司);湘儀H1650-W 高速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 試藥

對照品尿嘧啶(批號100469-200401)、鳥嘌呤(批號140631-200904)、次黃嘌呤(批號140661-200301)、尿苷(批號887-200202)、腺嘌呤(批號110886-200001)、肌苷(批號40669-201104)、腺苷(批號110879-200202)(中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98%);鳥苷(批號1001103046)、2'-脫氧鳥苷(批號1000943454)、2'-脫氧腺苷(批號2513C105)(美國Sigma 公司，純度均＞98%)。水為超純水，甲醇為色譜純(德國默克公司)，其余試劑為分析純。

玄參樣品采集自道地產(chǎn)區(qū)浙江省磐安縣，采收時間分別為:S1—2014年10月3 日，S2—2014年10月10 日，S3—2014年10月18 日，S4—2014年10月24 日，S5—2014年11月2 日，S6—2014年11月8 日，S7—2014年11月15 日，S8—2014年11月22日，S9—2014年12月5 日，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根，留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實驗室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Atlantis T3(2.1 mm×150 mm，3 μm);流動相:甲醇(A)-5 mmol/L 醋酸銨水溶液(含0.1%冰醋酸，B);梯度洗脫:0～4.5 min，3%～4%A;4.5～8 min，4%～18% A;8～10 min，18% A;10～10.1 min，18%～3% A;10.1～13 min，3% A。柱溫35 ℃，流速0.4 mL/min，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源:Turbo V，電離模式:(ESI+);采集方式MRM;離子化溫度(TEM):650 ℃。噴霧電壓:5500 V ;霧化氣(GS1):65 L/min;輔助氣(GS2):65 L/min;氣簾氣(CUR):30 L/min，優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷、2'-脫氧腺苷對照品適量，加純水配制成質(zhì)量濃度分別為213.00、168.00、160.00、1011.00、190.00、156.00、1042.00、66.00、414.00、91.50 μg/mL 的對照品儲備液。取各對照品儲備液適量，置10 mL 量瓶中，加水定容，配制成尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷、2'-脫氧腺苷質(zhì)量濃度分別為21.30、16.80、16.00、101.10、19.00、15.60、104.20、6.60、41.40、9.15 μg/mL 的混合溶液，并按2、5、10、50、100、200 倍逐級稀釋，得到一系列不同濃度的10 種核苷混合對照品溶液，供分析用。

表1 優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Optimized MS/MS parameters

2.4 供試品溶液制備

取玄參粉末1.0 g(過80 目)，精密稱定，置于25 mL 具塞錐形瓶中，加入10 mL 超純水，室溫下超聲(500 W、40 kHz)提取45 min，提取液12000 rpm離心取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限

精密吸取“2.3”項下不同濃度系列對照品溶液及混合對照品儲備液各2 μL，在“2.1”、“2.2”色譜-質(zhì)譜條件下測定，以對照品的峰面積(Y)對相應(yīng)的濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍;逐步稀釋各對照品溶液，按信噪比(S/N)約為3 計算檢測限(LOD)，以S/N 約為10 計算定量限(LOQ)，見表2。

表2 10 種核苷標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限Table 2 Calibration curves，LODs，and LOQs of 10 nucleosides

圖1 對照品(A)及樣品(B)提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms (EIC)of reference substances (A)and sample (B)

2.5.2 精密度試驗

精密吸取稀釋后的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定各對照品峰面積，所得峰面積的RSD 分別為:尿嘧啶1.9%、鳥嘌呤1.9%、次黃嘌呤1.2%、尿苷2.0%、腺嘌呤1.5%、肌苷2.3%、鳥苷5.7%、2'-脫氧鳥苷4.8%、腺苷2.8%、2'-脫氧腺苷3.8%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗

取S4 號樣品的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，測定尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷和2'-脫氧腺苷的峰面積，所得峰面積的RSD 值分別為1.6%、1.3%、0.8%、2.3%、3.9%、2.8%、2.3%、1.0%、1.8%、2.4%。

2.5.4 重復(fù)性試驗

取S4 號樣品粉末各6 份，分別按“2.4”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定各成分含量，計算相應(yīng)的RSD。尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷和2'-脫氧腺苷的RSD 分別為2.4%、1.9%、1.4%、1.4%、2.7%、0.5%、3.6%、1.8%、0.7%、1.1%。

2.5.5 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品粉末(S4 號樣品)各6 份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入一定量的尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷和2'-脫氧腺苷對照品，按照供試品溶液制備方法制備加樣回收率供試品溶液，在“2.1”、“2.2”項下的色譜—質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，計算回收率。計算得出尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷和2'-脫氧腺苷的平均回收率分別為3.44%、2.72%、3.36%、3.49%、2.78%、2.84%、4.63%、3.40%、2.67%、1.76%。

2.6 樣品測定

將供試品溶液注入液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，依法測定，根據(jù)相應(yīng)線性關(guān)系計算供試樣品中10 種核苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 不同采收期玄參樣品中10 種核苷的的含量(μg/g，n=2)Table 3 Contents of 10 nucleosides in Scrophulariae Radix samples with different harvesting periods (μg/g，n=2)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，核苷類化學(xué)成分對人體免疫、代謝以及肝臟、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)揮著重要的生理作用，且具有抗菌和抗病毒等生理活性，尤以腺苷的藥理作用最為明顯，如腺苷具有改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和免疫調(diào)節(jié)等［6］。玄參的滋陰功效在現(xiàn)代藥理學(xué)上體現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)作用。因此，核苷類成分作為玄參藥材質(zhì)量控制或考察采收期的一項指標(biāo)具有一定的科學(xué)性。

實驗結(jié)果表明，玄參藥材中10 種核苷類成分含量差異較大，以鳥苷、尿苷、腺苷、尿嘧啶的含量較高，鳥嘌呤、次黃嘌呤、2'-脫氧鳥苷和2'-脫氧腺苷的含量較低。鳥苷含量的波動較大，主要表現(xiàn)為在10月初其含量較高，隨之呈現(xiàn)遞減趨勢;從10月下旬開始，鳥苷含量又呈現(xiàn)遞增趨勢;在11月份鳥苷含量保持平穩(wěn)。尿苷和腺苷含量在10月初呈現(xiàn)下降趨勢，從10月中旬開始又呈現(xiàn)上升趨勢，在10月下旬基本保持平穩(wěn)。尿嘧啶的含量保持平穩(wěn)狀態(tài)。通過不同采收期核苷總量變化折線圖可以得出核苷含量自10月初呈現(xiàn)下降趨勢，從10月中旬呈現(xiàn)上升趨勢，在11月份核苷含量基本保持平穩(wěn)，在12月初核苷含量稍有下降。不同采收期玄參中核苷類成分含量呈現(xiàn)動態(tài)變化，以11月份采收的玄參藥材中主含核苷及核苷總量較為平穩(wěn)且處在較高水平。綜上結(jié)果，從核苷這一指標(biāo)成分動態(tài)變化的角度，支持了玄參藥材產(chǎn)地傳統(tǒng)采收期的合理性，與2015年版《中國藥典》規(guī)定的冬季莖葉枯萎時采挖基本一致。至于玄參藥材適宜采收期的確定還需對玄參中的環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷類、有機(jī)酸類成分等多元指標(biāo)成分以及藥材產(chǎn)量進(jìn)行綜合考察，仍有待于進(jìn)一步深入研究。

本實驗建立了UPLC-QTRAP-MS/MS 同時測定玄參中10 種核苷類成分含量的方法，分析了不同采收期玄參中核苷積累的動態(tài)變化，從而為深入探討玄參藥材的品質(zhì)形成機(jī)制及確定其藥材適宜采收期提供基礎(chǔ)資料，同時為玄參藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和全面控制提供了新的方法參考。

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