柳葉擬沉香所產沉香的化學成分研究

邵 杭，梅文莉，李 薇，蓋翠娟，朱國鵬，戴好富*

1海南大學園藝園林學院，海口 570228;2 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室;3 海南省沉香工程技術研究中心，海口 571101

柳葉擬沉香(Gyrinops salicifoliaRidl)是瑞香科(Thymelaeaceae)擬沉香屬(Gyrinops)的一種常綠喬木，是巴布亞·新幾內亞特有樹種［1］。迄今為止，全世界共發現8 種擬沉香屬植物，主要分布于東南亞地區以及印度尼西亞群島一帶，與沉香屬(Aquilaria)植物一起被認為是能產沉香的物種［2，3］，且均被列入了《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)附錄Ⅱ。沉香作為傳統名貴藥材和天然香料，具有行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘的功能，可用于治療胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急［4］。現代藥理學研究表明，沉香具有抗菌［5］、抗癌［6，7］、消炎［8］、神經保護［9，10］和降血糖［11］等功效。目前各國學者對沉香屬植物所產沉香的化學成分研究較多，發現其主要為倍半萜和2-(2-苯乙基)色酮類化合物［12-18］，而對擬沉香屬植物的化學成分研究甚少，其所產沉香的化學成分研究還未見報道。本次研究主要對柳葉擬沉香所產沉香的化學成分及其藥理活性進行研究，利用各種柱色譜和波譜學方法，共分離鑒定出8 個2-(2-苯乙基)色酮類化合物，均為首次從擬沉香屬植物所產沉香中分離得到，并采用Elman 比色法對全部化合物進行活性測試，結果表明化合物2～4、7 對乙酰膽堿酯酶具有一定的抑制活性。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

薄層層析硅膠板和柱色譜硅膠(200～300 目)和硅膠H 為青島海洋化工廠產品;Sephadex LH-20為Merck 公司產品;ODS(20～45 μm)為Fuji 公司產品;MS 譜在Autospec-3000 質譜儀上測定;NMR用Brucker AV-500 型超導核磁儀測定，以TMS 為內標;N-1000(2L)立式旋轉蒸發儀為上海愛朗儀器有限公司;SHZ-D(ш)循環真空泵為上海隆拓儀器設備有限公司;DX-2015 低溫循環機為北京長流科學儀器有限公司;BP221S 萬分之一電子秤為北京賽多利斯天平有限公司;乙酰膽堿酯酶(041M7009V)、碘化硫代乙酰膽堿(BCBF0420V)、二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)(SHBD2937V)、他克林(07220AV)均購自Sigma 公司;ELX-800 酶標儀購自美國寶特公司;超凈工作臺為上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗材料

本實驗樣品于2014年12月購買于澳門，經中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所王軍博士鑒定該沉香的源植物為柳葉擬沉香Gyrinops salicifoliaRidl，憑證標本(CX20141222)存放于中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所。

2 提取與分離

柳葉擬沉香根產沉香(491.1 g)用95%乙醇加熱回流提取三次，減壓濃縮，得到乙醇提取物(177.4 g)，將提取物分散于水中成懸濁液，用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物(141.2 g)，正丁醇萃取物(26.8 g)。乙酸乙酯部分采用硅膠(硅膠H)減壓柱，以氯仿-甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脫，分段收集得到10 個流分(Fr.1～10)。Fr.2(5.1 g)經ODS(甲醇-水=3∶7～1∶0)梯度洗脫，得到14 個流分(Fr.2-1～Fr.2-14)。Fr.2-7(190.0 mg)經Sephadex LH-20(氯仿-甲醇=1∶1)，再經反復硅膠柱(200～300 目)色譜(石油醚-乙酸乙酯=30∶1)洗脫，得到化合物2(11.2 mg)。Fr.2-8(340.0 mg)經Sephadex LH-20(甲醇)，再經反復硅膠柱(200～300目)色譜(石油醚-乙酸乙酯=20∶1)洗脫，得到化合物1(5.3 mg)和3(13.5 mg)。Fr.3(7.2 g)經Sephadex LH-20(甲醇)，再經ODS(甲醇-水=3∶7～1∶0)梯度洗脫，得到19 個流分(Fr.3-1～Fr.3-19)。Fr.3-5(143.4 mg)經Sephadex LH-20(甲醇)，再經反復硅膠柱(200～300 目)色譜(氯仿-甲醇=100∶1)洗脫，得到化合物4(10.4 mg)。Fr.3-6(99.3 mg)經Sephadex LH-20(甲醇)，得到Fr.3-6-1(66.0 mg)。Fr.3-6-1(66.0 mg)再經反復硅膠柱(200～300 目)色譜(氯仿-甲醇=200∶1)洗脫，得到化合物8(5.3 mg)。Fr.4(11.5 g)經Sephadex LH-20(甲醇)，再經ODS(甲醇-水=3∶7～1∶0)梯度洗脫，得到11 個流分(Fr.4-1～ Fr.4-11)。Fr.4-3(180.9 mg)經Sephadex LH-20(甲醇)，再經反復硅膠柱(200～300目)色譜(氯仿-甲醇=100∶1、80∶1)洗脫，得到化合物5(4.1 mg)、6(4.0 mg)和7(6.3 mg)。

3 結構鑒定

化合物1 無色油狀;ESI-MSm/z273 ［M +Na］+;分子式為C17H14O2;1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:8.21 (1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-5)，7.68(1H，dd，J=7.7，6.0 Hz，H-7)，7.46 (1H，d，J=8.4 Hz，H-8)，7.41 (1H，t，J=7.6 Hz，H-6)，7.28(5H，m，H-2'，H-3'，H-4'，H-5'，H-6')，6.18 (1H，s，H-3)，3.09 (2H，m，H-7')，2.97 (2H，m，H-8');13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:168.5 (C-2)，110.4 (C-3)，178.4 (C-4)，125.1 (C-5)，125.9 (C-6)，133.7(C-7)，118.0 (C-8)，156.6 (C-9)，123.9 (C-10)，139.9 (C-1')，128.8 (C-2'，C-6')，128.4 (C-3'，C-5')，126.7 (C-4')，33.1 (C-7')，36.3 (C-8')。以上波譜數據與文獻［16］對照基本一致，故鑒定該化合物為2-(2-苯乙基)色酮。

化合物2 黃色粉末;ESI-MSm/z305 ［M +Na］+，281 ［M-H］-;分子式為C17H14O4;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.19 (5H，m，H-2'，H-3'，H-4'，H-5'，H-6')，7.09 (1H，d，J=8.8 Hz，H-7)，6.59(1H，dd，J=8.8，1.2 Hz，H-6)，6.02 (1H，s，H-3)，3.04 (2H，m，H-7')，2.94 (2H，m，H-8');13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:170.1 (C-2)，108.6 (C-3)，183.7 (C-4)，139.6 (C-5)，110.2 (C-6)，121.8 (C-7)，137.1 (C-8)，152.1 (C-9)，110.8 (C-10)，144.8 (C-1')，128.7 (C-2'，C-6')，128.3 (C-3'，C-5')，126.6 (C-4')，32.8 (C-7')，35.9 (C-8')。以上波譜數據與文獻［13］對照基本一致，故鑒定該化合物為5，8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮。

化合物3 黃色粉末;ESI-MSm/z335 ［M +Na］+，311 ［M-H］-;分子式為C18H16O5;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.40 (1H，d，J=9.2 Hz，H-7)，7.37 (2H，d，J=9.2 Hz，H-2'，H-6')，7.07(2H，d，J=8.6 Hz，H-3'，H-5')，6.88 (1H，d，J=8.8 Hz，H-6)，6.29 (1H，s，H-3)，4.02 (3H，s，4'-OCH3)，3.30(2H，m，H-8')，3.23 (2H，m，H-7');13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:171.3 (C-2)，109.1(C-3)，184.4 (C-4)，152.4 (C-5)，110.6 (C-6)，122.4 (C-7)，138.0 (C-8)，145.6 (C-9)，111.3 (C-10)，132.3 (C-1')，129.8 (C-2'，C-6')，114.5 (C-3'，C-5')，158.8 (C-4')，55.5 (4'-OCH3)，32.4 (C-7')，36.8 (C-8')。以上波譜數據與文獻［13］對照基本一致，故鑒定該化合物為5，8-二羥基-2-［2-(4-甲氧基苯)乙基］色酮。

化合物4 淡粉色粉末;ESI-MSm/z305［M +Na］+，281 ［M-H］-;分子式為C17H14O4;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.25 (4H，m，H-2'，H-3'，H-5'，H-6')，7.17 (1H，m，H-4')，6.87 (1H，d，J=2.8 Hz，H-5)，6.77 (1H，d，J=2.6 Hz，H-7)，6.06(1H，s，H-3)，3.10 (2H，m，H-7')，2.98 (2H，m，H-8');13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:170.7 (C-2)，109.6 (C-3)，180.7 (C-4)，99.1 (C-5)，156.2 (C-6)，109.6 (C-7)，148.9 (C-8)，142.2 (C-9)，125.7(C-10)，141.3 (C-1')，129.5 (C-2'，C-6')，129.4(C-3'，C-5')，127.3 (C-4')，33.9 (C-7')，37.2 (C-8')。以上波譜數據與文獻［17］對照基本一致，故鑒定該化合物為6，8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮。

化合物5 無色油狀;ESI-MSm/z335 ［M +Na］+，311 ［M-H］-;分子式為C18H16O5;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:9.72 (1H，s，4'-OH)，9.21(1H，s，6-OH)，7.24 (1H，s，H-5)，7.13 (1H，s，H-8)，7.03 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，H-6')，6.66(2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，H-5')，6.03 (1H，s，H-3，)，3.90 (3H，s，7-OCH3)，2.87 (4H，m，H-7'，H-8');13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:167.8 (C-2)，108.8 (C-3)，176.1 (C-4)，107.2 (C-5)，144.9(C-6)，153.5 (C-7)，100.4 (C-8)，151.0 (C-9)，116.5 (C-10)，130.2 (C-1')，129.2 (C-2'，C-6')，115.2 (C-3'，C-5')，155.7 (C-4')，31.4 (C-7')，35.3 (C-8')，56.2 (7-OCH3)。以上波譜數據與文獻［10］對照基本一致，故鑒定該化合物為6-羥基-7-甲氧基-2-［2-(4-羥基苯)乙基］色酮。

化合物6 淡黃色粉末;ESI-MSm/z365［M +Na］+，341 ［M-H］-;分子式為C19H18O6;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.63 (1H，s，H-5)，7.37 (1H，s，H-8)，7.02 (1H，d，J=1.87 Hz，H-2')，6.96(1H，d，J=8.00 Hz，H-6')，6.91 (1H，dd，J=8.03，1.94 Hz，H-5')，6.34 (1H，s，H-3)，4.27 (3H，s，6-OCH3)，4.01 (3H，s，4'-OCH3)，3.26 (2H，m，H-7')，3.22 (2H，m，H-8');13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:170.9 (C-2)，109.9 (C-3)，180.1 (C-4)，108.4 (C-5)，148.9 (C-6)，155.6 (C-7)，100.8 (C-8)，153.7 (C-9)，117.8 (C-10)，132.9 (C-1')，116.2 (C-2')，146.6 (C-3')，146.0 (C-4')，113.2(C-5')，121.9 (C-6')，33.9 (C-7')，37.4 (C-8')，57.0 (6-OCH3)，56.3 (4'-OCH3)。以上波譜數據與文獻［10］對照基本一致，故鑒定該化合物為6-甲氧基-7-羥基-2-［2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基］色酮。

化合物7 淡黃色油狀;ESI-MSm/z365［M +Na］+，341 ［M-H］-;分子式為C19H18O6;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.65 (1H，s，H-5)，6.89 (1H，s，H-8)，6.81 (1H，d，J=2，4 Hz，H-2')，6.78 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5')，6.67 (1H，dd，J=8.2，2.4 Hz，H-6')，6.10 (1H，s，H-3)，4.03 (3H，s，7-OCH3)，3.88 (3H，s，4'-OCH3)，2.97 (2H，t，J=2.8 Hz，H-7')，2.87 (2H，t，J=3.3 Hz，H-8');13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:167.9 (C-2)，109.7 (C-3)，177.9 (C-4)，108.4 (C-5)，145.8 (C-6)，152.1(C-7)，99.2 (C-8)，152.1 (C-9)，117.9 (C-10)，133.2 (C-1')，114.6 (C-2')，144.0 (C-3')，145.4(C-4')，110.9 (C-5')，119.8 (C-6')，32.6 (C-7')，36.3 (C-8')，56.6 (7-OCH3)，56.1 (4'-OCH3)。以上波譜數據與文獻［10］對照基本一致，故鑒定該化合物為6-羥基-7-甲氧基-2-［2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基］色酮。

化合物8 淡黃色粉末;ESI-MSm/z335［M +Na］+，311 ［M-H］-;分子式為C18H16O5;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.44 (1H，d，J=9.0 Hz，H-8)，7.40 (1H，dd，J=3.1，1.7 Hz，H-5)，7.24 (1H，ddd，J=9.1，3.0，1.5 Hz，H-7)，6.79 (1H，d，J=2.2 Hz，H-2')，6.70 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5')，6.64(1H，ddd，J=8.2，4.1，2.0 Hz，H-6')，6.11 (1H，s，H-3)，3.82 (3H，s，3'-OCH3)，2.96 (4H，m，H-7'，H-8');13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:171.0 (C-2)，109.6 (C-3)，180.5 (C-4)，108.7 (C-5)，155.9 (C-6)，124.3 (C-7)，120.3 (C-8)，151.8 (C-9)，124.9(C-10)，133.8 (C-1')，112.6 (C-2')，147.2 (C-3')，147.3 (C-4')，116.2 (C-5')，120.2 (C-6')，33.2 (C-7')，37.1 (C-8')，56.4 (3'-OCH3)。以上波譜數據與文獻［18］對照基本一致，故鑒定該化合物為6-羥基-2-［2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基］色酮。

4 活性檢測

用Elman 法［19］測定化合物1～8 和乙酸乙酯萃取物的抗乙酰膽堿酯酶活性。待測樣品均用DMSO進行溶解。取110 μL 磷酸緩沖液(pH 8.0)，10 μL待測樣品(50 μg/mL)和40 μL 乙酰膽堿酯酶(0.02 μg/mL)于96 孔板中，溫育20 min(30 ℃)，之后加入DTNB(2.48 mg/mL)和碘化硫代乙酰膽堿(1.81 mg/mL)等體積混合液20 μL，反應體系總共200 μL，30 min 后，405 nm 處酶標儀進行檢測。陽性對照為他克林，反應終濃度為0.08 μg/mL，陰性對照為DMSO，反應終濃度為0.1%，實驗3 次重復。按照(E-S)/ E × 100% 來計算化合物對乙酰膽堿酯酶的抑制率(E 為陰性對照平均吸光值，S 為待測樣品的平均吸光值)。測試結果(見表1)表明，乙酸乙酯萃取物和化合物2～4、7 對乙酰膽堿酯酶具有一定的抑制活性。

表1 乙酸乙酯萃取物與化合物1-8 的乙酰膽酯酶抑制活性(濃度:50 μg/mL)Table 1 AChE inhibitory activity of EtOAc extract and compounds 1-8 at 50 μg/mL

5 結果與討論

本實驗采取多種色譜技術，從柳葉擬沉香所產沉香中分離得到了8 個2-(2-苯乙基)色酮類化合物，均為首次從擬沉香屬植物所產沉香中分離得到。乙酰膽堿脂酶抑制活性測試結果顯示，化合物2～4、7 對乙酰膽堿酯酶具有一定的抑制活性。

本次研究發現2-(2-苯乙基)色酮類化合物是柳葉擬沉香所產沉香的一類主要化學成分，與沉香屬植物所產沉香的主要化學成分類別一致。2-(2-苯乙基)色酮類化合物是評價沉香品質的主要成分之一［20］，本次研究結果豐富了擬沉香屬植物所產沉香的化學成分，不僅為更好地探索擬沉香屬植物結香機制奠定了理論基礎，也為該屬植物及其所產沉香的開發和利用提供了科學依據。

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