苦瓜甾醇對對乙酰氨基酚致小鼠肝損傷的保護作用

楊志剛，潘龍銀，王心睿

常熟理工學(xué)院生物工程系，常熟 215500

藥源性肝炎是一種在臨床實踐中嚴(yán)重威脅健康的常見病、多發(fā)病。由于肝臟首關(guān)效應(yīng)的作用，一些藥物經(jīng)長期或大量口服后，代謝物淤積在肝臟組織，就會損傷肝組織，引發(fā)肝炎。對乙酰氨基酚是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，低劑量不至于損傷肝細(xì)胞，但大劑量或長期服用，則在肝內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生大量自由基堆積而引起肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，損傷細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)胞毒性，致使炎癥發(fā)生，肝功能受損。

植物甾醇是一類以環(huán)戊烷全氫菲為骨架的天然醇類化合物，天然植物甾醇種類繁多，主要包括豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇4 種無甲基甾醇，廣泛存在于植物細(xì)胞與組織中，已被確認(rèn)具有免疫調(diào)節(jié)、消炎退熱、降低血脂和膽固醇、減少動脈粥樣硬化損傷、清除自由基及護養(yǎng)皮膚等多種生理功效，廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生行業(yè)，深受消費者的青睞［1-3］。

苦瓜甾醇對肝損傷影響的相關(guān)研究尚未見報道。本實驗觀察對肝損傷模型小鼠施加不同劑量苦瓜甾醇后的生理指標(biāo)變化，探討苦瓜甾醇對小鼠肝損傷的保護作用及機理。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級ICR 健康雄性小鼠48 只，體重(25 ±3)g，南通大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK(蘇)2014-001。

1.2 藥物與試劑

苦瓜甾醇提取物BMSE(按黃賢校等方法［4］實驗室制備，純度85.36%);對乙酰氨基酚(天津市健生制藥有限公司);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、白蛋白(ALB)、考馬斯亮藍(lán)蛋白(TP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。其余試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模

小鼠48 只，隨機分為6 組:正常對照組，模型對照組(濃度40 mg/mL，即4 g 對乙酰氨基酚溶于100 mL 生理鹽水中，腹腔注射10 mg/kg，現(xiàn)用現(xiàn)配)、陽性對照組(聯(lián)苯雙脂60 mg/kg)、苦瓜甾醇低劑量組(50 mg/kg)、中劑量(100 mg/kg)、高劑量(200 mg/kg)，每組8 只。本實驗用橄欖油作為溶劑來溶解聯(lián)苯雙酯和苦瓜甾醇。

1.3.2 給藥

正常對照組和模型對照組小鼠灌服10 mg/kg橄欖油，陽性對照組和苦瓜甾醇各劑量組分別按照劑量給予相應(yīng)的藥物，每曰早、晚各給藥一次，連續(xù)給藥7 d，最后一次給藥后2 h 開始禁食，除正常對照組外其余各組一次性腹腔注射對乙酰氨基酚400 mg/kg［5］，正常對照組腹腔注射10 mg/kg 生理鹽水，禁食(自由飲水);24 h 后，各組經(jīng)眼球后靜脈叢取血，測定血清中ALT、AST、ALB、TP 的含量;取肝臟，用4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重，計算肝臟系數(shù)(肝臟重量/體重)。取肝右葉相同部位0.2 g肝組織，以1.8 mL 4 ℃生理鹽水制成10%肝勻漿，3500 rpm 離心10 min，取上清液待測，測定各組肝組織SOD、MDA、GSH-PX。部分肝臟切片鏡檢，觀察肝臟損傷程度。

1.3.3 血清及肝組織生化指標(biāo)檢測

摘除小鼠眼球取血，靜置，3000 rpm，離心15 min，按試劑盒說明測定血清中ALT、AST 活性及ALB、TP 含量;取出肝臟，用4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，取部分肝臟，剪碎后加入9 倍生理鹽水，在冰浴中用電動玻璃勻漿機制10%肝勻漿液，3000 rpm 離心15 min，取上清液，按試劑盒說明測定肝組織中SOD、GSH-PX 活性和MDA 含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPASS13.0 進行t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜甾醇對肝損傷小鼠血清中ALT、AST 活性及ALB、TP 含量的影響

結(jié)果見表1。肝損傷模型組小鼠血清中ALB、TP 水平與正常對照組比較，顯著降低(P＜0.01)，而ALT、AST 水平和肝臟系數(shù)與正常對照組比較顯著增加(P＜0.01)。苦瓜甾醇低劑量組小鼠與對肝損傷模型組比較，血清中ALB、TP 水平略有升高，ALT、AST 水平和肝臟系數(shù)略有降低，但未顯現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，而苦瓜甾醇中、高劑量組小鼠血清中ALB、TP 水平顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01)，ALT、AST水平和肝臟系數(shù)顯著降低(P＜0.05 或P＜0.01)，且呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。

2.2 苦瓜甾醇對肝損傷小鼠肝組織中SOD、GSHPX 活性和MDA 含量的影響

結(jié)果見表2。與正常對照組比較，小鼠肝臟SOD、GSH-PX 活性在對乙酰氨基酚致肝損傷模型組顯著降低(P＜0.01)，而MDA 含量顯著增加(P＜0.01)。與對乙酰氨基酚致肝損傷模型組比較，苦瓜甾醇低劑量組小鼠肝臟組織中SOD、GSH-PX 活性升高，MDA 含量下降，但未顯現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，而苦瓜甾醇中、高劑量組小鼠肝臟組織中SOD、GSH-PX活性均顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01)，MDA 含量顯著下降(P＜0.05 或P＜0.01)，且呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。

表1 小鼠血清中ALT、AST 活性，TP、ALB 含量和肝臟指數(shù)(± s，n=8)Table 1 ALT，AST activity，TP，ALB content and liver index in mice liver (± s，n=8)

表1 小鼠血清中ALT、AST 活性，TP、ALB 含量和肝臟指數(shù)(± s，n=8)Table 1 ALT，AST activity，TP，ALB content and liver index in mice liver (± s，n=8)

注:與正常對照組相比，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P ＜0.01;Compare with model，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

表2 小鼠肝臟組織中SOD、GSH-PX 活性，MDA 含量(±s，n=8)Table 2 SOD，GSH-PX activity and MDA content in mice liver(±s，n=8)

表2 小鼠肝臟組織中SOD、GSH-PX 活性，MDA 含量(±s，n=8)Table 2 SOD，GSH-PX activity and MDA content in mice liver(±s，n=8)

注:與正常對照組相比，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P ＜0.01;Compare with model，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

2.3 苦瓜甾醇對肝損傷小鼠肝組織的影響

實驗可見，正常對照組小鼠肝臟外觀呈現(xiàn)紅褐色，大小形態(tài)正常，表面被膜光滑，色澤紅潤，質(zhì)軟而脆，鏡下結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯變性和壞死;模型對照組小鼠肝臟明顯腫大，彈性減弱，表面有點狀出血，鏡下呈現(xiàn)局灶性壞死癥狀;苦瓜甾醇各劑量組和陽性對照組可以減輕肝細(xì)胞損傷程度，顯著改善細(xì)胞變性和壞死，有效地保護肝臟，尤其是苦瓜甾醇高劑量組作用顯著，效果與陽性對照組相近;結(jié)果見表3、圖1。肝損傷程度分級:“-”:正常肝組織;“+”:肝細(xì)胞變性或點狀壞死;“++”:肝細(xì)胞變性或局灶性壞死;“+++”:肝小葉不到1/3 肝細(xì)胞壞死。

3 討論與結(jié)論

肝損傷的防治目前仍是一個全球性的嚴(yán)峻課題。通過建立實驗性肝損傷動物模型，篩選保肝藥物，探索保肝作用機制，具有重要的現(xiàn)實意義［6］。對乙酰氨基酚是解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床上常作為阿司匹林的替代用藥，長期服用時或大劑量使用時可導(dǎo)致嚴(yán)重毒性效應(yīng)。實驗中小鼠腹腔注射對乙酰氨基酚后，肝臟出現(xiàn)中毒性肝炎、肝壞死等病理現(xiàn)象，形成肝損傷模型［7，8］。苦瓜甾醇各劑量組小鼠肝臟系數(shù)減少，說明對乙酰氨基酚引起的肝臟炎癥反應(yīng)受到了苦瓜甾醇的抑制，肝臟損傷程度減輕，肝臟腫大被緩解。

血清中ALT、AST 的含量是評價肝損傷的重要標(biāo)志。當(dāng)肝細(xì)胞受到損害時，細(xì)胞膜通透性改變，ALT、AST 釋放入血液，致使血清中ALT 和AST 的含量上升。灌服苦瓜甾醇組小鼠能保持血清ALT、AST 的較低水平狀態(tài)，表明灌服苦瓜甾醇在一定程度上緩減了對乙酰氨基酚對小鼠肝細(xì)胞膜的急性損傷。肝細(xì)胞內(nèi)ALB、TP 具有抗氧化劑、損傷修復(fù)功能，在肝功能受損時合成與分泌減少［9］。本實驗中苦瓜甾醇中高劑量灌服組小鼠肝細(xì)胞ALB、TP 含量明顯高于模型組，表明苦瓜甾醇有助于ALB、TP 蛋白合成與分泌，有效預(yù)防肝組織遭受急性損傷引發(fā)細(xì)胞代謝紊亂。

表3 苦瓜甾醇對肝損傷小鼠肝組織病理改變的影響(±s，n=8)Table 3 Pathological changes of tissue in mice liver (±s，n=8)

表3 苦瓜甾醇對肝損傷小鼠肝組織病理改變的影響(±s，n=8)Table 3 Pathological changes of tissue in mice liver (±s，n=8)

注:與正常組比較，##P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with control，##P ＜0.01;Compared with model，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

圖1 對照組(A)、模型組(B)、苦瓜甾醇高劑量組(C)、聯(lián)苯雙酯組(D)中小鼠肝組織病理變化(HE 染色，25 ×)Fig.1 Histopathological changes of rat liver from control group (A)，model group (B)，phytosterol group (high-dose)(C)and bifendate group (D)(HE staining，25 ×)

MDA 是膜脂過氧化產(chǎn)物，其濃度間接反映機體細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度;SOD 為超氧自由基清除因子，其含量可間接反映機體清除自由基的能力［10，11］。本實驗中苦瓜甾醇各劑量組小鼠相比較模型組，MDA 含量均有降低，SOD 活力均有提高，表明苦瓜甾醇有助于清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，防止細(xì)胞膜受損，遲滯細(xì)胞腫脹壞死，對對乙酰氨基酚所致肝損傷有顯著的保護作用。GSH-PX 是機體內(nèi)廣泛存在的一種含硒抗氧化酶，可以清除由活性氧和羥自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，以阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性［12］。當(dāng)對乙酰氨基酚攝入量過大時，其代謝產(chǎn)物量超過GSH 的清除能力，加劇膜脂質(zhì)過氧化，引發(fā)肝損傷，苦瓜甾醇有助于保持GSH 活性和肝臟解毒能力，緩減肝臟受損程度。

綜上所述，苦瓜甾醇有助于緩減對乙酰氨基酚引發(fā)肝組織炎癥反應(yīng)，維持體內(nèi)SOD、GSH-PX 等酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，防止細(xì)胞膜受損和細(xì)胞代謝紊亂，從而起到對急性肝損傷的保護作用，可能成為肝損傷預(yù)防與治療的候選輔助藥物。

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