蠟梅與光葉紅蠟梅和夏蠟梅屬間雜交親和性初步研究

王文鵬，周莉花，趙宏波，2，包志毅

（1.浙江農林大學風景園林與建筑學院，浙江 臨安311300；2.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安311300）

蠟梅與光葉紅蠟梅和夏蠟梅屬間雜交親和性初步研究

王文鵬1，周莉花1，趙宏波1，2，包志毅1

（1.浙江農林大學風景園林與建筑學院，浙江 臨安311300；2.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安311300）

為了選育蠟梅科Calycanthaceae植物新品種，拓展育種親本，以蠟梅Chimonanthus praecox，光葉紅蠟梅Calycanthus floridus var.glaucus和夏蠟梅Sinocalycanthus chinensis為實驗材料，利用低溫或超低溫保存花粉克服屬間雜交花期不遇，應用熒光鏡檢技術檢測花粉與雌蕊互作，來探討蠟梅屬Chimonanthus與美國蠟梅屬Calycanthus和夏蠟梅屬Sinocalycanthus屬間雜交親和性。結果表明：以變色硅膠干燥2 h，而后利用液氮保存3個月的蠟梅花粉活力保持最高（12.7%），授粉后在夏蠟梅和光葉紅蠟梅柱頭上均能黏附和萌發，能用于屬間雜交；而以類似方法保存的夏蠟梅和光葉紅蠟梅花粉未檢測到活力，授粉后在母本柱頭上只觀察到少量花粉黏附而未觀察到花粉萌發。以夏蠟梅和光葉紅蠟梅分別為母本，蠟梅為父本，其花粉黏附、萌發和花粉管生長動態基本一致：授粉后6 h花粉在母本柱頭上黏附，授粉后12 h花粉萌發長出花粉管，24 h至36 h花粉管繼續向下生長，約48 h到達花柱基部，開始進入胚囊。這表明以蠟梅為父本，與夏蠟梅和光葉紅蠟梅雜交在花粉-雌蕊互作和花粉管生長階段不存在雜交障礙，而反交親和性有待于改進花粉保存方法后進一步研究。圖5表1參24

園藝學；蠟梅；夏蠟梅；光葉紅蠟梅；屬間雜交；花粉活力；雜交親和性

蠟梅科Calycanthaceae植物在園林上有廣泛的應用。蠟梅Chimonanthus praecox為中國傳統名花，盛開于寒冬臘月，花色為黃白色，清香四溢，是真正意義上的冬季香花植物。夏蠟梅Sinocalycanthus chinensis是第三季孑遺物種，屬于中國特有的單種屬，主要分布于浙江省臨安市和天臺縣，為中國二級珍稀瀕危保護植物，花期5月，其花被片二型，外花被片白色，內花被片金黃色、肉質，無香味，具有極高的觀賞價值［1］。美國蠟梅Calycanthus floridus花褐紫色，具清香，盛花期為4－5月，是蠟梅科植物育種中花色、花香改良不可多得的材料；它原產于美國東部，喜溫暖濕潤的環境，耐高溫，也耐寒冷，適應性強，在充足的陽光下生長良好，但在陽光暴曬下，花被片前端呈現焦枯狀，影響其觀賞價值。光葉紅蠟梅Calycanthus floridus var.glaucus為美國蠟梅一變種，它與美國蠟梅的區別主要是葉、葉柄及幼枝無毛或近無毛。廣泛的雜交有助于擴大植物的基因庫［2］，而父母本的親緣關系對雜交親和性有重要影響［3］。蠟梅科植物的遠緣雜交最早見于Lasseigne等的報道，獲得了夏蠟梅與美國蠟梅的屬間雜種，并利用反復的雜交和進一步的回交選育了不同花色的品種［4］。姚青菊等［5］也獲得了夏蠟梅與美國蠟梅的屬間雜種，雜種的性狀介于雙親之間，在光合特性等方面表現出一定的雜種優勢。我們也利用常規雜交方法獲得了美國蠟梅（母本）和夏蠟梅（父本）的屬間雜種，但結實率很低。因此，王文鵬等［6］研究了美國蠟梅和夏蠟梅屬間雜交障礙機制，發現雜交障礙主要由母本雌蕊較高比例的發育異常和雜種胚的早期敗育共同引起。Wang等［7］和趙宏波等［8］研究了蠟梅屬蠟梅、柳葉蠟梅Ch.salicifolius和亮葉蠟梅Ch.nitens等3種之間的雜交親和性，結果表明：雙受精后的雜種胚（球形胚之后）胚乳發育滯后是種間雜交障礙的最主要原因。蠟梅科不同屬植物具有各自顯著的特點，如能利用遠緣雜交轉移或整合相關性狀將極大地豐富蠟梅科植物的觀賞性狀，拓展育種親本。關于蠟梅屬與美國蠟梅屬和夏蠟梅屬的屬間雜交未見相關報道。本研究利用低溫或超低溫保存父本花粉，克服花期不遇，利用熒光鏡檢技術觀察雙親花粉和雌蕊互作（花粉黏附與萌發、花粉管在花柱中的生長），以揭示蠟梅屬與美國蠟梅屬、蠟梅屬與夏蠟梅屬屬間雜交親和性，為進一步遠緣雜交育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為浙江農林大學校園內多年生且能正常開花的蠟梅株系LM5（圖1a），夏蠟梅（圖1b）和光葉紅蠟梅（圖1c）。蠟梅花期為當年12到翌年2月，夏蠟梅花期為5月，光葉紅蠟梅花期為4月下旬到5月中旬。于2011－2012年的1-2月、5月和12月分別進行花粉收集和保存與雜交授粉實驗。

圖1 實驗材料Figure 1 Experimental materials

1.2 方法

1.2.1 花粉的保存與活力測定 由于蠟梅與美國蠟梅和夏蠟梅存在花期不遇現象，給雜交造成一定的困難，因此，雜交需要利用花粉離體保存。于每年1-2月盛花期采集蠟梅松蕾期花朵，在實驗室用鑷子取下花藥，置于細孔篩上，將細孔篩置于硫酸紙上，將硫酸紙置于在白熾燈下干燥2 h，待花藥裂開后，收集花粉，隨后將花粉置于硫酸紙上，放入干燥器中利用變色硅膠干燥，設置0，1，2和4 h等4個處理，然后將花粉裝入冷凍管，保存于超低溫冰箱和液氮中。于5月以同樣方法采集和保存夏蠟梅和光葉紅蠟梅的花粉。在雜交前取出花粉進行活力檢測，參考周莉花等［9］的離體萌發法。以300 g·kg-1聚乙二醇6000（PEG 6000）+100 mg·L-1硼酸（H3BO4）為花粉培養液，將培養液滴于載玻片上，將花粉散在載玻片上，置于培養皿中，內置濕棉球保濕，加蓋，在暗培養條件下，25℃培養12 h，顯微鏡（Nikon BX-40）下觀察花粉萌發情況。花粉管的長度大于花粉的直徑計為萌發。花粉活力=已萌發花粉粒數目/花粉粒總數×100%。

1.2.2 雜交授粉 于每年5月，以夏蠟梅和光葉紅蠟梅為母本進行雜交授粉，選取松蕾期花朵，剪去花瓣（不傷及柱頭），用鑷子去除雄蕊，然后用鉛筆橡皮頭沾取冷凍管中的花粉，涂抹至柱頭，套袋并掛牌。于當年12月至翌年2月，蠟梅為母本，以同樣方法授以夏蠟梅和光葉紅蠟梅花粉，套袋并掛牌記錄。授粉過的花朵分為2部分，一部分被固定用于檢測花粉-雌蕊互作，而另一部分用于統計結實率（所有雜交組合最終均未獲得成熟果實）。

1.2.3 花粉萌發和花粉管生長熒光鏡檢 于授粉后1，2，6，12，24，36，48，72，和96 h將花取下，FAA［V（乙醇）∶V（蒸餾水）∶V（乙酸）∶V（甲醛）=9∶9∶1∶1］固定24 h以上，用刀片輕輕剖開子房，取出連著胚囊的柱頭，用4 mol·L-1氫氧化鈉（NaOH）軟化脫色2 h，然后用10 g·L-1苯胺藍溶液浸泡8 h染色，甘油壓片，熒光顯微鏡（Leica DM4000）觀察并拍照［9］。

2 結果與分析

2.1 花粉超低溫保存

由表1可以看出：經變色硅膠干燥后，超低溫保存的蠟梅花粉，在3個月后仍然具有活力（圖2a），最高可至12.7%，最低為2.6%，說明超低溫保存是保證花粉活力的有效辦法。-80℃（超低溫冰箱）與-196℃（液氮）保存無顯著差別，干燥時間以1 h和2 h最為適宜，不干燥或干燥時間過長反而造成花粉活力下降。而光葉紅蠟梅和夏蠟梅的花粉在保存數月后未檢測到活力（圖2b和圖2c）。

表1 保存溫度和干燥時間對蠟梅花粉生活力的影響Table 1 Effect of preservation temperature and dehydration time on pollen germination of Chimonanthus praecox

圖2 花粉萌發狀態Figure 2 Pollen germination

2.2 光葉紅蠟梅與蠟梅屬間雜交花粉萌發和花粉管生長特性

光葉紅蠟梅作母本，蠟梅做父本時，以超低溫保存的蠟梅花粉可以萌發出花粉管，并達到胚囊，說明超低溫保存的花粉能用于屬間雜交。授粉后6 h即有大量花粉粒黏附（圖3A）；至12 h，觀察到花粉已經萌發出花粉管（圖3B，圖3G）；24～36 h，花粉管繼續向胚囊方向生長（圖3C和圖3E）；48 h到達花柱基部（圖3F），偶然觀察到24 h花粉管已經到達花柱基部（圖3D）。由于光葉紅蠟梅和夏蠟梅子房壁表面密被柔毛，花粉管進入胚囊的進一步過程未能觀察到，但根據花粉管的生長狀態和蠟梅屬植物雜交組合的授粉受精情況判斷［7］，花粉管應能正常進入胚囊完成受精。

蠟梅做母本，光葉紅蠟梅做父本時，只觀察到少量花粉粒的黏附（圖5D），各時間點均未觀察到花粉管進一步生長。

圖3 光葉紅蠟梅×蠟梅授粉后花粉萌發和花粉管生長情況Figure 3 Pollen germination and pollen tube growth in C.floridus var.glaucus×Ch.praecox after pollination

2.3 夏蠟梅與蠟梅屬間雜交花粉萌發和花粉管生長特性

夏蠟梅做母本時，以蠟梅為父本，最早于授粉后12 h在花柱中觀察到花粉管（圖4a），24～36 h花粉管繼續向胚囊方向生長（圖4b，圖4c），至48 h到達花柱基部（圖4d）。蠟梅作母本，夏蠟梅做父本時，各時間點均能觀察到一定數量的花粉黏附，但數量較少，一般少于10個，未觀察到花粉管的進一步生長（圖5a，圖5b，圖5c）。

3 結論與討論

花粉是植物的雄配子，高活力的花粉是進行雜交的前提。對花期不遇的物種進行雜交，調節花期和花粉保存是主要的方法；相比于調節花期，花粉保存簡便易行且便于長途運輸，以超低溫長時間保存花粉已經在很多植物上應用。鳳梨Aechmea fasciata花粉干燥4 h后在－80℃保存6個月，仍具有65%的活力［10］。Vriesea ‘Leen’的花粉在－80℃保存6個月后，活力沒有顯著變化；但授粉后，結實率與新鮮花粉相比，從53%降至11%［11］。Panella等［12］用在液氮中保存了17 a（1991－2008）的甜菜Beta vulgaris花粉進行授粉，發現能正常授粉并產生后代，保存的花粉與新鮮花粉活力并無顯著不同，只是萌發出的花粉管更小而已。超低溫保存導致花粉死亡的主要原因是：在冷凍過程中，細胞內的水分形成冰晶，導致細胞膜受損，花粉失活［13］。花粉既具有耐干旱性又有對水分缺失的敏感性，失水過多也會導致花粉死亡，故選取合適的干燥時間將其含水量控制在一定范圍至關重要。Hughes［14］研究Clianthus formosus的花粉超低溫保存時，發現投入液氮前干燥3 h，花粉具有最大活力。陳珊［15］利用－70℃和－196℃保存經過干燥的蠟梅不同基因型的花粉，保存1 a后仍具有較高活力，部分基因型甚至可以保持20%以上。本研究中亦發現：以干燥2 h保存3個月后，蠟梅花粉活力最高，而用同樣方法保存的夏蠟梅與光葉紅蠟梅花粉未檢測到活力。這可能是由于蠟梅花期為冬季，本身活力維持時間較長且含水量相對較低［16］；而夏蠟梅與光葉紅蠟梅花期為夏季，花粉活力喪失較快且含水量較高。從授粉后花粉在柱頭上的萌發和花粉管的生長來看，超低溫保存的蠟梅花粉可以應用于遠緣雜交；而夏蠟梅與光葉紅蠟梅花粉保存后未檢測到活力，不能應用于遠緣雜交，今后應進一步改進花粉保存方法。

圖4 夏蠟梅×蠟梅授粉后花粉萌發和花粉管生長情況Figure 4 Pollen germination and pollen tube growth in S. chinensis×Ch.praecox after pollination

圖5 蠟梅×夏蠟梅和蠟梅×光葉紅蠟梅的花粉粘附情況Figure 5 Pollen adherence after pollination of Ch.praecox×S. chinensis and Ch.praecox×Ch.floridus var.glaucus

遠緣雜交一般存在受精前障礙和受精后障礙。受精前障礙起因于柱頭與花粉的相互作用，花粉粒不能萌發或萌發出的花粉管半途停止生長，不能到達胚囊完成受精等；受精后障礙主要是不能獲得雜種種子或雜種不活，大多由于胚乳與胚發育不協調或胚敗育［17－18］。受精前障礙可以通過改進授粉技術加以克服，而受精后障礙可以通過雜種胚離體培養克服［19－21］。在蠟梅科中，美國蠟梅和夏蠟梅屬間雜交［6］、蠟梅屬種間雜交［7－8］均存在受精后障礙，主要原因為雜種胚胚乳發育滯后。本研究發現，盡管蠟梅屬與美國蠟梅屬和夏蠟梅屬存在顯著的花期不遇，利用離體超低溫保存的花粉具有一定的活力可以有效克服，進行授粉部分組合表現出一定的雜交親和性，但所有組合最終均未獲得雜種種子。以美國蠟梅屬光葉紅蠟梅和夏蠟梅屬夏蠟梅分別為母本，蠟梅為父本，父本花粉均能萌發，花粉管能在花柱中生長并最終到達胚囊，說明屬間雜交不存在受精前障礙，雜交障礙存在于受精后。

很多植物間的遠緣雜交具有單方向性。Datson［22］進行龍面花屬Nemesia的種間雜交時發現，只有當N.foetans做母本，N.anisocarpa做父本時，雜交具有親和性，而反交則無親和性；Boavida［23］在歐洲栓皮櫟Quercus suber種間雜交授粉中發現，Q.suber與Q.ilex雜交只有單方向親和，即Q.ilex作母本時親和，可產生雜交種子。Repkova［24］進行車軸草屬不同倍性的Trifolium pretense（2x，4x）與3個野生種（T. alpestre，T.medium和 T.sarosiense）雜交，發現只有用四倍體的T.pretense做母本,T.medium做父本時，具有親和性，反交則雜交不親和。而蠟梅屬與美國蠟梅屬、蠟梅屬與夏蠟梅屬屬間雜交是否存在這一現象，還需要進一步研究。

初步結論：研究了蠟梅科屬間雜交親和性，驗證了以超低溫保存蠟梅花粉在雜交中的可行性，而以同樣方法不能保存夏蠟梅和美國蠟梅花粉；美國蠟梅屬與蠟梅屬、夏蠟梅屬與蠟梅屬屬間雜交正交具有一定的親和性，不存在受精前障礙，受精后障礙的具體表現及其原因則需進一步研究。

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Intergeneric cross-compatibility from pollen-pistil interactions of three Calycanthaceae species

WANG Wenpeng1,ZHOU Lihua1,ZHAO Hongbo1,2,BAO Zhiyi1
（1.School of Landscape Architecture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.The Nurturing Station for the Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang, China）

To breed new cultivars and increase breeding parent combinations,intergeneric cross-compatibility between Chimonanthus praecox and Calycanthus floridus var.glaucus,and between Chimonanthus praecox and Sinocalycanthuschinensiswasanalyzed by determining pollen-pistilinteraction through fluorescence microscopy.To overcome the asynchronous flowering period,different methods，including low temperature and ultra-low temperature,were used to store pollen from these three species.Pollen viability in Chimonanthus praecox reached 12.7%after 3 months of crypreservation storage but was negligible for the other two species. When S.chinensis and Calycanthus floridus var.glaucus were used as female parents,pollen grains germinated and pollen tubes grew along the style.Pollen germination and growth characteristics between two intergeneric crosses were similar.About 6 h after pollination,pollen attached on stigmas and germinated 12 h after pollination;from 24 h to 36 h pollen tubes grew further along the styles reaching and entering the embryo sac at 48 h.Thus,Chimonanthus praecox pollen could be used as a male parent for crosses,and no barriers werefound in the pollen-pistil interaction stage for crosses of Chimonanthus praecox and Calycanthus floridus var. glaucus or Chimonanthus praecox and S.chinensis.［Ch,5 fig.1 tab.24 ref.］

horticulture;Chimonanthus praecox;Sinocalycanthus chinensis;Calycanthus floridus var.glaucus; intergeneric cross;pollen viability;cross-compatibility

S685.99；S722.7

A

2095-0756（2015）05-0756-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.05.015

2014-11-24；

2015-03-09

國家自然科學基金資助項目（31101571，31401902）；浙江省自然科學基金資助項目（Y3100332）；浙江省農業重大科技專項重點項目（2012C12909-9，2012C12909-19）

王文鵬，從事觀賞植物遺傳育種研究。E-mail：wangwenniao@163.com。通信作者：趙宏波，副教授，博士，從事觀賞植物遺傳育種和植物繁殖生態研究。E-mail：zhaohb@zafu.edu.cn