黃花杓蘭菌根真菌rDNA ITS的多樣性

繆福俊，蔣 宏，王宏虬，原曉龍，陳 劍，楊宇明，王 娟

（1.云南省林業科學院 國家林業局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室 云南省森林植物培育與開發利用重點實驗室,云南昆明650201；2.西南林業大學林學院，云南 昆明650224）

黃花杓蘭菌根真菌rDNA ITS的多樣性

繆福俊1，蔣 宏1，王宏虬2，原曉龍1，陳 劍1，楊宇明1，王 娟1

（1.云南省林業科學院 國家林業局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室 云南省森林植物培育與開發利用重點實驗室,云南昆明650201；2.西南林業大學林學院，云南 昆明650224）

杓蘭屬Cypripedium植物因具較高的觀賞和藥用價值而長期被過度采集，已成為瀕危植物。菌根真菌是其栽培和保育能否成功的重要協同因子。采用免培養技術對滇西北4個不同居群的黃花杓蘭Cypripedium flavum毛根的真菌進行核糖體脫氧核糖核酸內轉錄間隔區（rDNA ITS）區段擴增。結果表明：從4個居群的毛根中共克隆得到366個真菌ITS-taxa，其中白水河居群93個，石卡雪山居群90個，天生橋居群103個，納帕村居群80個；黃花杓蘭毛根系統中存在豐富多樣的菌根真菌類型，分別涉及膠膜菌屬Tulasnella，伏革菌屬Corticium，瘤菌根菌屬Epulorhiza和絲核菌屬Rhizoctoia 4個屬及一類歸屬未定的真菌（uncultured mycorrhizal fungi）；膠膜菌屬對于黃花杓蘭具有一定的寄主專一性特征，可能對黃花杓蘭的生長有促生作用。以上結果為菌肥的研制和黃花杓蘭植物的栽培與保育工作提供科學依據。圖1表3參24

微生物學；黃花杓蘭；菌根真菌；rDNA ITS；膠膜菌屬；多樣性

Key words:microbiology;Cypripedium flavum;mycorrhizal fungi;rDNA ITS;Tulasnella；diversity

黃花杓蘭Cypripedium flavum屬蘭科Orchidaceae杓蘭屬Cypripedium植物，為中國特有種，分布于云南西北部、西藏東南部、四川、甘肅南部和湖北西部的高海拔地區，是一種典型的多年生高山草本植物［1］。因其花型獨特、色彩艷麗，是整個蘭科植物中最具特色的類群之一，極具觀賞價值。然而，人類對杓蘭野生環境的日益破壞，使得黃花杓蘭種群數量急劇下降。該種已處于瀕危狀態，亟待保護［2－3］。目前，在杓蘭屬植物保育工作中，因多數自花不育導致自然結實率較低，種子微小，多采取分株繁殖和組織培養方式進行擴繁種苗［4－5］。在此過程中存在一個很大的瓶頸：在擴繁種苗過程中，杓蘭幼苗出現生長緩慢、死亡率高等常見問題，極大地限制了瀕危植物杓蘭的保育工作［6－7］。前人的研究表明：蘭科植物對菌根真菌具有較高的依賴性，菌根可能成為杓蘭營養代謝的重要協同因子［8］。在自然條件下，蘭屬植物必須與真菌建立共生關系，其種子萌發、幼苗生長發育以及成年蘭屬植物營養的獲取才得以實現［9］。Harley等［8］于1983年首次證實杓蘭和真菌是互利的關系。同時Hadley等［10］也認為：平衡的共生關系可在一定條件下變為寄生關系，接種根際促生菌可顯著提高杓蘭幼苗的成活率。Shimura等［11］的研究表明：兩者可能是斗爭的關系，但通過前期的斗爭，一旦真菌與杓蘭建立共生關系后，可互利共生。王瑞苓等［12］通過對黃花杓蘭植株根的生長周期切片觀察，也證實菌根真菌與黃花杓蘭是互惠互利的共生關系。臧穆等［13］在黃花杓蘭的根際和根皮層細胞內發現了不同階段的小型菌核，菌核的存在表明：杓蘭和真菌是協同的關系。侯天文等［14］研究發現：四川黃龍溝杓蘭的菌根真菌多樣性隨生長季節轉換呈現的變化規律與營養需求規律是基本一致的。高倩等［15］對黃花杓蘭，云南杓蘭Cypripedium yunnanense,西藏杓蘭Cypripedium tibeticum和斑花杓蘭Cypripedium guttatum的菌根結構及其周年動態變化進行了研究，發現真菌的新近入侵、開始被消解、消解后的殘余及消解后的物質4個階段在這4種杓蘭的生活周期中周而復始地進行。上述前人的研究主要集中于菌根解剖結構特征觀察和真菌的入侵方式等方面，有關杓蘭屬植物菌根真菌多樣性的研究還缺乏報道。本研究前期調查發現，黃花杓蘭在滇西北高海拔區域分布較多，這為研究杓蘭屬植物菌根真菌提供極好的試驗材料。本研究以黃花杓蘭毛根為材料，提取總DNA，采用免培養巢式聚合酶鏈式反應（PCR）技術擴增其真菌核糖體脫氧核糖核酸內轉錄隔離區（rDNA ITS）區段，并對不同居群黃花杓蘭的菌根真菌多樣性進行分析，為杓蘭屬植物的保育和開發利用方面提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采樣地的地理位置信息詳見表1。采集時間為杓蘭花盛開期（2013年6月10日）。黃花杓蘭為地生蘭，生于林緣，樣地為腐殖質土壤。根據采樣地點分為4個不同的居群，對每種選樣植株（居群）中隨機選取5株進行取樣，在黃花杓蘭的根尖處選取毛根段10個·株－1，長約1 cm。用水洗凈根尖土壤，置于裝有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）緩沖液的1.5 mL離心管中，避光低溫儲存。

表1 滇西北黃花杓蘭采樣居群表Table 1 Sample collection of Cypripedium flavum at Northwest of Yunnan

1.2 方法

1.2.1 樣品總DNA的提取 采用天根DNA試劑盒提取各樣品中的總DNA。

1.2.2 樣品rDNA ITS區段擴增和多樣性分析 采用Nest PCR方法擴增，第1輪PCR擴增引物為NSI1和NLB4（NSI1：5′-GATTGAATGGCTTAGTGAG-3′，NLB4：5′-GGATTCTCACCCTCTATGA-3′）。反應體系為：1.0 μL模板DNA，1.0 μL NSI1，1.0 μL NLB4，9.5 μL雙蒸水（ddH2O），12.5 μL Prime STAR Max DNA Premix（2×）。反應條件為：98℃30 s，60℃5 s，72℃10 s，30次循環，72℃1 min。

第2輪PCR擴增引物為NSI1-F和ITS4（NSI1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。反應體系為：1.0 μL第1輪Nest PCR產物做模板DNA，1.0 μL NSI1-F，1.0 μL ITS4，9.5 μL ddH2O，12.5 μL Prime STAR Max DNA Premix（2×）。反應條件為：98℃10 s，55℃5 s，72℃10 s，30次循環，72℃1 min。

將擴增出的PCR產物分別用限制性內切酶Hinf1和Alu1進行酶切分析。反應體系為：3.0 μL PCR產物，1.0 μL內切酶緩沖液（10×），1.0 μL內切酶，5.0 μL雙蒸水。37℃水浴4 h。經電泳檢測，分析限制性片段長度多態性（RFLP）帶型。將代表不同的RFLP帶型的單克隆樣品挑出，連接載體pEASYBlunt轉入Trans1-T1感受態細胞中，挑取陽性克隆，用菌液PCR法（M13F、M13R引物）鑒定重組子，確認包含重組子的克隆，送上海生工公司用M13F和M13R引物測序。測序結果用DNAman去除載體后使用在線軟件NCBI Blast進行比對分析。

1.2.3 多樣性指數計算 集中性測度：λ=Σ［Ni（Ni-1）/N（N-1）］；多樣性測度：D=1-Σ ［Ni（Ni-1）/N（N-1）］，公式中N為樣方中物種總體個數，Ni為第i種個體數。

2 結果與分析

2.1 黃花杓蘭毛根中真菌rDNA ITS區段聚合酶鏈反應（PCR）擴增結果

黃花杓蘭部分毛根總DNA的提取電泳結果如圖1A所示，其真菌rDNA ITS區段擴增結果如圖1B所示，表明提取的總DNA條帶清晰，采用巢式PCR可較好地擴增得到rDNA ITS區段，大小均在750 bp左右。

圖1 黃花杓蘭毛根中真菌rDNA ITS PCR擴增的電泳結果Figure 1 Agarose gel electrophoresis results of rDNA ITS PCR amplification products of mycorrhizal fungi from Cypripedium flavum

2.2 黃花杓蘭毛根中真菌ITS序列分析結果

從4個不同居群黃花杓蘭的毛根中直接提取的總DNA，通過Nest PCR擴增及克隆建立了4個克隆庫，總共得到了366個單克隆，其中從白水河居群中得到93個單克隆，從石卡雪山居群中得到90個單克隆，從天生橋居群中得到103個單克隆，從納帕村居群中得到80個單克隆。

2.3 不同居群黃花杓蘭ITS序列多樣性分析

從表2可見：白水河居群涉及3個真菌屬，分別屬于瘤菌根菌屬Epulorhiza，歸屬未定真菌（Uncultured mycorrhizal fungi）和膠膜菌屬Tulasnella，均屬典型的蘭科菌根真菌類型。其中，瘤菌根菌屬占大多數，頻率為58.1%，同源性為97%，其次是膠膜菌屬，與美胞膠膜菌Tulasnella calospora的同源性高達98%，可初步確定為美胞膠膜菌。集中性指數λ=0.489，多樣性測度D=0.511；石卡雪山居群涉及3個真菌屬，分別屬于膠膜菌屬、絲核菌屬Rhizoctoia和瘤菌根菌屬。其中，膠膜菌屬占大多數，頻率為41.1%，同源性為98%，其次是絲核菌屬。集中性指數λ=0.350，多樣性測度D=0.650；天生橋居群涉及3個真菌屬，分別屬于膠膜菌屬，伏革菌屬Corticium和瘤菌根菌屬。膠膜菌屬占大多數，頻率為69.9%，同源性為97%，其次是伏革菌屬。集中性指數λ=0.568，多樣性測度D=0.432；納帕村居群涉及1個真菌屬，全部屬于膠膜菌屬，與美胞膠膜菌的同源性高達99%。集中性指數λ=0.640，多樣性測度D=0.360。

表2 黃花杓蘭菌根真菌rDNA ITS序列的Blast比對結果Table 2 Blast results of rDNA ITS sequences of mycorrhizal fungi from Cypripedium flavum

2.4 不同居群黃花杓蘭菌根真菌類型

從表3可見：4個居群的黃花杓蘭菌根系統中涉及4個真菌屬，其中膠膜菌屬、瘤根菌屬和伏革菌屬隸屬于擔子菌亞門Basdiomycotina，絲核菌屬隸屬于半知菌亞門Deuteromycotina，還有一類歸屬未定的真菌，所占頻率最少，為1.0%。說明不同居群的黃花杓蘭菌根系統中可能存在豐度不同的真菌菌落結構，如白水河居群真菌群落豐富多樣，涉及3個真菌屬，但在納帕村黃花杓蘭居群只有膠膜菌屬，其多樣性較為單一。膠膜菌屬在每一個居群中都出現且占有較大的比例，高達61.2%。

表3 黃花杓蘭菌根不同屬真菌的比例Table 3 Number ratio from different genus of mycorrhizal fungi from C.flavum

3 結論與討論

本研究首次采用微生物免培養技術對滇西北4個不同居群的黃花杓蘭植物的毛根總DNA進行提取，用真菌ITS區2對引物NSI1/NLB4和NSI1-F/ITS4直接擴增毛根中真菌的ITS區段，免去了微生物純培養的過程。從4個不同居群的黃花杓蘭毛根中總共克隆得到366個真菌ITS-taxa，與NCBI數據中的菌根真菌進行比對，表明均屬菌根真菌類型。說明黃花杓蘭菌根系統中存在豐富多樣的真菌類型，此方法能較好地反應黃花杓蘭菌根中真菌多樣性水平，能快速的獲得菌根真菌生態系統中的真菌群落類型。

目前研究已知，感染蘭科植物根部并能與之共生的真菌類型約有擔子菌亞門的7個屬（瘤菌根菌屬，膠膜菌屬，臘殼菌屬Sebacina，念珠菌根菌屬Moniliopsis，角擔菌屬Ceratobasidium，層孔菌屬Fomes和伏革菌屬）；半知菌亞門的1個屬（絲核菌屬）和子囊菌亞門的1個屬（毛殼菌屬Chaetomium）［16-18］。而本研究發現：4個居群黃花杓蘭菌根真菌類型（膠膜菌屬、瘤菌根菌屬、絲核菌屬和伏革菌屬）為典型的蘭科植物菌根真菌，均在蘭科植物菌根真菌系統中已報道。其中，膠膜菌屬在每一個居群中都占有較大的比例，且在每個居群中都出現，說明膠膜菌屬可能是黃花杓蘭菌根真菌系統中的優勢種群，存在著一定的寄主特異性。這與已有的研究結果一致。對膠膜菌屬的美孢膠膜菌進行研究發現，該菌能促進蘭科植物（石斛Dendrobium candidum和地寶蘭Geodorum eulophioides）的種子萌發，可能對蘭科植物的定植和生長有促進作用［19］。在本研究的另外3個居群中都涉及到瘤菌根菌屬真菌，所占比例僅次于膠膜菌屬，說明有瘤菌根菌屬對黃花杓蘭也有著一定的寄主特異性。相關研究也表明，分離自蘭科植物的瘤根菌屬和膠膜菌屬真菌共同促進蘭科植物的生長發育［20－21］。Oliveira等［22］對巴西4種蘭花不同居群的菌根真菌進進行菌群多樣性研究發現，其根內生真菌主要為臘殼菌屬，高達81.61%，對這4種蘭花有著寄主專一性。另外，在3個居群的黃花杓蘭菌根系統中涉及3種類型的真菌，說明不同種的真菌能促進同一種杓蘭植物生長發育。這很可能是因為這些真菌皆能提供蘭科植物萌發生長所需要的營養物質，它們之間存在營養專一性［23－24］，此結論還有待進一步研究證實。

［1］ 蔡凝楓,嚴寧,胡虹,等.黃花杓蘭云南中甸居群遺傳結構及克隆多樣性的分析［J］.云南植物研究,2008,30（1）：69－75.

CAI Ningfeng,YAN Ning,HU Hong,et al.Genetic structure and clonal diversity of Cypripedium flavum（Orchidaceae）populaitons from South-west China［J］.Acta Bot Yunnan,2008,30（1）：69－75.

［2］ 于永福.中國蘭花狀況調查［J］.森林與人類,2004,24（5）：26－27.

YU Yongfu.The orchids in China［J］.For Hum,2004,24（5）：26－27.

［3］ CRIBB P.The Genus Cypripedium［M］.Oregon：Timber Press,1997：126－127.

［4］ 鄭桂靈,李鵬,臺永東,等.杓蘭屬植物的開花和結實動態［J］.生態學報,2010,30（12）：3182－3187.

ZHENG Guiling,LI Peng,TAI Yongdong,et al.Flowering and fruit set dynamics in Cypripedium［J］.Acta Ecol Sin, 2010,30（12）：3182－3187.

［5］ 黃家林,胡虹.黃花杓蘭種子無菌萌發的培養條件研究［J］.云南植物研究,2001,23（1）：105－108.

HUANG Jialin,HU Hong.Seed germination requirements of Cypripedium flavum in axenic culture ［J］.Acta Bot Yunnan,2001,23（1）：105－108.

［6］ 馬全寶，張建軍.2個杓蘭品種及其栽培管理技術［J］.甘肅農業科技,2009（11）：54－55.

MA Quanbao,ZHANG Jianjun.Two kinds of Cypripedium and its cultivation manager techniques［J］.Gansu Agric Sci Technol,2009（11）：54－55.

［7］ 李鵬,羅毅波.中國特有蘭科植物褐花杓蘭的繁殖生物學特征及其與西藏杓蘭的生殖隔離研究［J］.生物多樣性, 2009,17（4）：406－413.

LI Peng,LUO Yibo.Reproductive biology of an endemic orchid Cypripedium smithii in China and reproductive isolation between C.smithii and C.tibeticum［J］.Biodivers Sci,2009,17（4）：406－413.

［8］ HARLEY J L,SMITH S.Mycorhizal Symbiosis［M］.London：Academic Press,1983：203－205.

［9］ 趙國英,徐寶萍,董然.杓蘭屬植物研究現狀［J］.北方園藝,2013（8）：185－188.

ZHAO Guoying,XU Baoping,DONG Ran.Research status of Cypripedium plants［J］.Northern Hortic,2013（8）：185－188.

［10］ HADLEY G.Orchid Biology：Reviews and Perspectives［M］.Ithaca：Cornell University Press,1982：83－118.

［11］ SHIMURA S,KODA Y.Enhanced symbiotic seed germination of Cypripedium macranthos var.rebunense following inoculation after cold treatment［J］．Physiol Plant,2005,123（3）：281－287.

［12］ 王瑞苓,胡虹,李樹云.黃花杓蘭與菌根真菌共生關系研究［J］.云南植物研究,2004,26（4）：445－450．

WANG Ruiling,HU Hong,LI Shuyun.Notes on symbiotic relationship between Cypripedium flavum and its mycorrhizal fungi［J］.Acta Bot Yunnanica,2004,26（4）：445－450.

［13］ 臧穆,王瑞苓,胡虹.黃花杓蘭根內的小型菌核［J］.云南植物研究,2004,26（5）：495－496.

ZANG Mu,WANG Ruiling,HU Hong.Bulbils exist in root of Cypripedium flavum［J］.Acta Bot Yunnan,2004,26（5）：495－496.

［14］ 侯天文,金輝,劉紅霞,等.四川黃龍溝優勢蘭科植物菌根真菌多樣性及其季節變化［J］.生態學報,2010,30（13）：3424－3432.

HOU Tianwen,JIN hun,LIU Hongxia,et al.The variations of mycorrhizal fungi diversity among different growing periods of the dominant orchids from two babitats in the Huanglong valley,Sichuan［J］.Acta Ecol Sin,2010,30（13）：3424－3432.

［15］ 高倩,李樹云,胡虹.4種杓蘭的菌根結構及其周年動態［J］.廣西植物,2009,29（2）：187-191.

GAO Qian,LI Shuyun,HU Hong.Structure and annual changing pattern of mycorrhizae of four Cypripedium species［J］.Guihaia,2009,29（2）：187－191.

［16］ 蓋雪鴿，邢曉科，郭順星.蘭科菌根的生態學研究進展［J］.菌物學報，2014,33（4）：753-767.

GAI Xuege,XING Xiaoke,GUO Shunxing.Ecological research of orchid mycorrhizae：a review［J］.Mycosystema, 2014,33（4）：753－767.

［17］ 王芝娜，李杰，張銀杰.中國蘭屬植物菌根真菌的rDNA ITS分析［J］.西北農林科技大學學報：自然科學版，2013,41（4）：191－196.

WANG Zhina,LI Jie,ZHANG Yinjie.rDNA ITS analysis of mycorrhizal fungi of Cymbidium plants［J］.J Northwest A&F Univ Nat Sci,2013,41（4）：191－196.

［18］ RASMUSSEN H N.Recent development in the study of orchid mycorrhiza［J］.Plant Soil,2002,244（1/2）：149－163.

［19］ 王麗琨.美孢膠膜菌（Tulasnella calospora）原生質體制備與CaCl2-PEG轉化初步試驗［D］.北京：北京林業大學, 2013.

WANG Likun.Protoplasts Formation and Preliminary Trial of PEG-mediated Transformation of Tulasnella calopspora［D］.Beijing：Beijing Forestry University,2013.

［20］ BOUGOURE J J,BOUGOURE D S,CAIRNEY J W G,et al.ITS-RFLP and sequence analysis of endophytes from Acianthus,Caladenia and Pterostylis（Orchidaceae）in Southeastern Queensland［J］.Mycol Res,2005,109（4）：452－460.

［21］ 李潞濱,胡陶,唐征,等.我國部分蘭屬植物菌根真菌rDNA ITS序列分析［J］.林業科學,2008,44（2）：160－164.

LI Lubin,HU Tao,TANG Zheng,et al.rDNA ITS analysis of mycorrhizal fungi in Cymbidium plants［J］.Sci Sliv Sin,2008,44（2）：160－164.

［22］ OLIVEIRA S F,BOCAYUVA M F,VELOSO T G,et al.Endophytic and mycorrhizal fungi associated with roots of endangered native orchids from the Atlantic Forest,Brazil［J］.Mycorrhiza,2014,24（1）：55－64.

［23］ DEARNALEY J D W.Further advances in orchid mycorrhizal research［J］.Mycorrhiza,2007,17（6）：475－486.

［24］ LIU Hongxia,LUO Yibo,LIU Hong.Studies of mycorrhizal fungi of Chinese orchids and their role in orchid conservation in China-a review［J］.Bot Rev,2010,76（2）：241－262.

The rDNA ITS diversity of mycorrhizal fungi with Cypripedium flavum

MIAO Fujun1,JIANG Hong1,WANG Hongqiu2,YUAN Xiaolong1,CHEN Jian1,YANG Yuming1,WANG Juan1
（1.Key Laboratory for Conservation of Rare,Endangered&Endemic Forest Plants,State Forestry Administration, Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants,Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201,Yunnan,China;2.School of Forestry,Southwest Forestry University,Kunming 650224,Yunnan, China）

Cypripedium plants,which are endangered by over-harvesting due to their high ornamental and medicinal value,use mycorrhizal fungi to guarantee cultivation and conservation.In order to explore the diversity of mycorrhizal fungi,the rDNA internal transcribed spacer（ITS）sequences from mycorrhizal fungi of four C.flavum populations（Baishui River,Shika Snow Mountain,Tiansheng Bridge,and Napa Village）were amplified by nested polymerase chain reaction（PCR）methods.Results showed a total of 336 distinct ITS-taxa of C. flavum obtained from clones of mycorrhizal fungi with populations from Baishui River（93）,Shika Snow Mountain （90）,Tiansheng Bridge （103）,and Napa Village （80）.Blast results of rDNA ITS sequences showed a rich diversity in mycorrhizal fungi systems with mycorrhizae belonging to Tulasnella,Corticium,Epulorhiza,and Rhizoctoia.Tulasnella fungi probably had host-specificity and growth-promoting effects on C.flavum.These results may provide a scientific basis for further conservation work of C.flavum and fungal manure development.［Ch,1 fig.3 tab.24 ref.］

S718.81；Q948.12

A

2095-0756（2015）07-0815-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.05.024

2014-12-08；

2015-01-22

云南省應用基礎研究計劃青年項目（2014FD070）；國家林業公益性行業科研專項（201204110）；云南省應用基礎研究重點項目（2013FA054）；云南省社會事業發展專項（2010CA010）；云南省中青年學術技術帶頭人后備人才培養項目（2010CI016）；云南藏區典型區域生態安全防控技術研究及應用示范項目；云南省教委濕地生態學創新團隊項目

繆福俊，研究實習員，從事根際微生物研究。E-mail：miaofujun@yeah.net。通信作者：王娟，教授，從事植物分子生物學與植物菌根研究。E-mail：schima@163.com