毛竹丙酮酸磷酸雙激酶調節蛋白基因克隆、原核表達及純化

王超莉，張智俊，屈亞平，王 蕾

（浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

毛竹丙酮酸磷酸雙激酶調節蛋白基因克隆、原核表達及純化

王超莉，張智俊，屈亞平，王 蕾

（浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

丙酮酸磷酸雙激酶調節蛋白（pyruvate,orthophosphate dikinase regulatory proteins,RP）是通過調控丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate,orthophosphate dikinase，PPDK）參與C4途徑光合碳循環途徑。毛竹Phyllostachys edulis作為一種重要的經濟竹種，分析克隆RP基因對于竹類植物光合作用的研究具有重大理論和應用價值。通過逆轉錄實時聚合酶鏈式反應（RT-PCR）成功克隆得到毛竹PeRP1，該基因cDNA全長1 275 bp，編碼425個氨基酸；經生物信息學預測，該蛋白屬于kinase-PPPase超家族，主要含有UDF 299保守結構域；經多序列比對發現毛竹PeRP1蛋白與C3植物中RP1親緣關系較近，而與C4植物親緣關系較遠。為了研究PeRP1的蛋白質結構，我們將PeRP1蛋白進行原核表達，利用Ni-NTA樹脂親和層析結合分子篩（SEC）層析的方法純化得到了PeRP1重組蛋白。SEC純化的結果表明：PeRP1蛋白在溶液中主要以多聚體形式存在，二聚體及單體含量較少，推測PeRP1蛋白可能以多聚體形式參與調控PPDK蛋白。這為今后研究該蛋白的結構與功能打下了良好基礎。圖7參15

植物學；毛竹；丙酮酸磷酸雙激酶調節蛋白；基因克隆；原核表達；蛋白純化

生物的一切物質和能量都來源于光合作用，碳4（C4）途徑是光合作用的一個重要途徑，是決定植物產量的關鍵因素之一。C4途徑是由碳3（C3）途徑進化而來的一種高光效種類。與C3途徑相比，它們具有高光強、高溫及低二氧化碳濃度下保持高光效的能力，C3植物同樣具有C4光合途徑中的酶［1］。丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate,orthophosphate dikinase，PPDK）是C4途徑的限速酶之一，而丙酮酸磷酸雙激酶調節蛋白（PPDK-RP或RP）是調節丙酮酸磷酸雙激酶活性的關鍵酶［2］。Burrell等［3］從植物的葉片直接分離得到了RP這個蛋白，但是分離得到的蛋白量比較少，且很不穩定。Burnell和Chastain［4］首次在玉米Zea mays中克隆到了RP基因，在體外獲得高表達量的蛋白。植物RP蛋白含有一個長度為299個氨基酸殘基的保守結構域UDF299，這個保守結構域在微生物RP中也存在，植物來源的UDF299可以調節PPDK，微生物來源的UDF299主要調節磷酸烯醇丙酮酸合成酶（phosphoenolpyruvate synthetase，PEPS）［5］。Chastain等［3,5］研究揭示了RP對PPDK的分子調節機制，即RP可催化PPDK活性部位色氨酸/蘇氨酸殘基的去磷酸化和磷酸化，從而改變 PPDK酶的活性和非活性狀態，最終影響植物光合碳循環。Chastain等［6－7］進一步發現擬南芥Arabidopsis thaliana中RP存在RP1和RP2等2種基因編碼形式，其中RP1定位于細胞葉綠體，具有蛋白激酶和磷酸酶活性，而RP2主要在細胞質中存在，無磷酸酶功能，僅具有蛋白激酶功能［6－7］。但迄今為止，由于RP晶體結構尚不清楚，這就造成RP蛋白與PPDK蛋白互作以及不同來源的RP結構和功能關系的研究缺乏結構生物學的直接證據。毛竹Phyllostachys edulis是一種重要的經濟竹種。本研究主要克隆毛竹RP1基因和預測了RP1基因相關生物信息學分析，同時構建高效原核表達體系，分離純化穩定的RP1蛋白，擬為毛竹RP1蛋白的空間結構及調節功能、竹類植物光合分子機制的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

材料為取自浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地培養室內半年生毛竹幼嫩葉片。

1.2 研究方法

1.2.1 毛竹幼苗RNA的提取和cDNA的合成 取新鮮、無病蟲害竹葉，液氮速凍，研磨成粉末，采用總RNA提取試劑（Trizol）提取試劑盒提取核糖核酸（RNA），利用逆轉錄試劑盒合成互補脫氧核糖核酸（cDNA）。

1.2.2 PeRP1基因的克隆 根據擬南芥的RP1基因序列，檢索毛竹表達序列標簽（EST）數據庫，得到一條同源序列，設計引物：上游BamHⅠ酶切位點引物F 5′-CGGGTACCATGATAAGCGCCAAG和下游HindⅢ酶切位點引物R 3′-CCCAAGCTTCTAGTACCGTTTTGATATGC（由上海生工生物工程技術服務有限公司合成）。以毛竹cDNA為模板，聚合酶鏈式反應（PCR）克隆RP1。

1.2.3 對目的片段進行生物信息學分析 利用DNAMAN軟件預測RP基因開放閱讀框（ORF），RP蛋白等電點、親疏水性，并對RP1蛋白同源序列進行多序列比對，用Mega 5.0軟件構建了系統發生樹分析RP1蛋白進化關系。

1.2.4 PeRP1原核表達載體構建 利用BamHⅠ與HindⅢ限制性內切酶雙酶切PCR產物，插入到原核表達載體（pe-SUMO），得到N-末端含有6個His親和標簽的重組子，熱激法將重組子轉化到表達細胞Escherichia coil（Ril），挑取陽性克隆，進行雙酶切和單酶切及測序驗證。

1.2.5 重組PeRP1蛋白的可溶性表達及純化 從抗氨芐平板上挑取單克隆，接入到600.0 μL的LB（Luria-Bertani）培養基中37℃培養過夜，從培養過夜的菌液中以1∶100接種到6.0 mL LB培養基，37℃培養，當菌液D（λ）值達到0.6～0.8時，加入終濃度為0.4 mmol·L－1的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），分別在37℃和20℃條件下誘導。收集菌液，超聲破碎，取樣，聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測蛋白表達及可溶性情況。將誘導收集的菌體懸浮在25.0 mL裂解液［20.0 mmol·L－1三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl），pH 8.5，200.0 mmol·L－1氯化鈉，50.0 g·L－1甘油］，超聲破碎，4℃，17 500 r·min－1離心，上清轉移至鎳柱，在冰上用搖床緩慢結合1.0～1.5 h后，分別用不同咪唑濃度梯度的緩沖液（0/20.0/40.0/60.0/ 80.0 mmol·L－1咪唑，20.0 mmol·L－1三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）pH 8.5，200.0 mmol·L－1氯化鈉）洗脫非特異性結合的雜蛋白，用洗脫液（100.0/200.0/300.0 mmol·L－1咪唑，20.0 mmol·L－1Tris-HCl pH 8.5，200.0mmol·L－1氯化鈉）洗脫目的蛋白。將洗脫的目的蛋白在10 kDa濃縮柱中濃縮至500.0 μL左右，用于分子篩層析，將濃縮的蛋白上樣，收集蛋白，用SDS-PAGE檢測，將純度較高的蛋白組份濃縮，－80℃保存。

2 結果與分析

2.1 PeRP1基因克隆

以毛竹cDNA為模板，PCR克隆得到1條約為1.3 kb的片段（圖1），雙向測序拼接后，發現該片段包含1個完整的開放閱讀框（ORF），長度為1 275 bp。

2.2 PeRP1的生物信息學分析

2.2.1 PeRP1蛋白序列與保守結構域 將PeRP1 cDNA序列中ORF框概念性翻譯成蛋白質氨基酸序列，發現PeRP1編碼1個含有425氨基酸殘基的蛋白質。此蛋白相對分子質量為 46.28 kDa，等電點為 8.04，第138～404氨基酸殘基為丙酮酸磷酸激酶調節蛋白的保守區DUF299（圖2）。

圖1 PeRP1基因的克隆Figure 1 Cloning of the PeRP1 gene

圖2 毛竹PeRP1基因開放閱讀框及氨基酸序列（圖中黑框為DUF299結構域）Figure 2 ORF of PeRP1 gene and the corresponding amino acid sequence

2.2.2 PeRP1氨基酸序列比對與系統進化樹分析 通過對不同植物來源RP1進行多序列比對發現，毛竹PeRP1編碼的蛋白序列與短花藥野生稻Oryza brachyantha的一致性高達91%，與玉米的一致性達70%，而與擬南芥的只有57%，在DUF299區序列相似度較高，都屬于kinase-PPPase超家族（圖3），說明植物RP1蛋白結構和功能較為保守。進一步采用MEGA5軟件構建了基于PeRP1編碼的氨基酸序列的系統進化樹（圖4）。進化樹結果表明：系統樹明顯分為單子葉植物與雙子葉植物2大分枝，其中單子葉植物分枝中，毛竹與短花藥野生稻，烏拉爾圖小麥Triticum urartu，二穗短柄草Brachypodium distachyon位于同一小分枝上，該分枝RP1來源于C3植物，但與單子葉C4植物及雙子葉植物的RP1親緣關系較遠，由此可推測毛竹植物光合碳循環可能為C3植物類型。

2.3 PeRP1重組蛋白的可溶性表達

將不同片段PeRP1重組子轉化到表達菌株Escherichia coli（Ril）感受態細胞，異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達后， SDS-PAGE電泳分析發現（圖5），毛竹RP1在37℃和20℃下均有表達， 但上清中只有20℃有表達，故在后續實驗中確定20℃為重組蛋白誘導表達的最佳條件。

2.4 PeRP1蛋白Ni-NTA純化

將超聲破碎離心后的上清加入Ni-NTA柱，帶有組氨酸標簽的目的蛋白特異性結合到Ni-NTA上，采用不同咪唑濃度梯度洗脫雜蛋白后，利用高濃度的咪唑洗脫出目的蛋白。圖6為咪唑梯度洗脫蛋白后的SDS-PAGE檢測，可以看出：在低濃度咪唑洗脫條件下可以很好的除去雜蛋白，在高濃度咪唑200.0 mmol·L-1條件下，則可很好洗脫出條帶單一目的蛋白，因此，PeRP1蛋白Ni-NTA親和層析純化的條件為：40.0 mmol·L－1咪唑，20.0 mmol·L－1Tris-HCl pH 8.5，200.0 mmol·L－1氯化鈉，洗脫雜蛋白；200.0 mmol·L－1咪唑，20.0 mmol·L－1Tris-HCl pH 8.5，200.0 mmol·L－1氯化鈉洗脫出目的蛋白。

圖3 不同植物RP1多序列比對Figure 3 Sequence multiple alignment of RP1 from different plants

2.5 PeRP1片段蛋白的分子篩層析

對上一步Ni-NTA純化得到的蛋白，進一步純化。目的蛋白在經過Superose 12 10/300 GL分子篩層析后，出現3個明顯的吸收峰。對比小牛血清白蛋白（BSA）出峰位置（單體D峰對應分子量為67 kDa，二聚體E峰對應分子為134 kDa），A峰對應的是RP1多聚體，B峰對應的是RP1二聚體100 kDa，C峰對應的是RP1單體50 kDa（圖7B）。分子篩層析后分管收集蛋白，取樣變性后跑SDS-PAGE膠（圖7A），結果顯示：不同的RP1蛋白聚合狀態的電泳條帶均同RP1理論分子量50 kDa一致，且蛋白純度在95%左右，說明RP1蛋白在溶液中存在多種蛋白聚合體狀態，Ni-NTA結合SEC可分離純化得到不同狀態的高純度RP1蛋白，可滿足今后蛋白晶體生長的要求。

圖4 不同植物RP1氨基酸序列構建的分子系統進化樹Figure 4 Molecular phylogenetic tree of RP1 from different plants

圖 5 PeRP1在表達菌株 Escherichia coli（Ril）中的表達Figure 5 Prokaryotic expression of PeRP1 in Escherichia coli（Ril）cells

圖 6 PeRP1 Ni-NTA親和層析純化的SDSPAG檢測Figure 6 SDS-PAG analysis from Ni-NTA affinity chromatography of PeRP1

3 討論

植物RP1作為C4途徑中的一種調節酶，決定了C4途徑光合作用的光合效率，對于植物的產量有重要影響。玉米RP1具有Ser/Thr激酶和磷酸酶活性，通過對PPDK調控位點Thr-456的氨基酸殘基進行可逆磷酸化來調控PPDK失活（磷酸化）和PPDK活化（去磷酸化）［8－10］，該過程是以腺苷二磷酸（ADP）為底物去參加調控反應的［10－11］。整體而言，RP1同大多數激酶調節蛋白不同，其具有3個顯著特征：①RP1為雙功能酶，即該蛋白同時具有蛋白激酶和磷酸酶活性，而大多數調節酶這兩個功能是分開的［12］；②催化底物去磷酸化時,依賴無機磷酸,生成焦磷酸；③催化底物磷酸化時，以ADP為底物，而不是以ATP作為底物［10－11］，證明與大多數蛋白磷酸酶通過水解去磷酸化的機制不同［13］。

圖7 PeRP1分子篩層析圖（A）及SDS-PAGE檢測（B）Figure 7 Purification of PeRP1 and BSA by size exclusion chromatography（A）and SDS-PAGE of SEC（B）

本研究首次成功克隆到了毛竹PeRP1基因，該基因具有1個完整的開放閱讀框（ORF），編碼425個氨基酸。生物信息學分析預測其含有1個保守結構域UDF299，序列比對發現毛竹RP1與同源RP1都含有這一保守結構域，屬于kinase-PPPase超家族。由于RP1是植物光合碳循環中一個重要的調節蛋白，結合蛋白序列比對和系統發生樹的結果，毛竹與C3植物的RP親緣性較高，證明C3植物同樣具有C4途徑的酶，這一結論與唐文莉等［14］和黃啟民等［15］研究結果相吻合。

從本研究PeRP1蛋白SEC純化的結果來看，毛竹PeRP1在20.0 mmol·L－1三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）pH 8.5，200.0 mmol·L－1氯化鈉溶液條件下，RP1以多聚體、二聚體、單體3種聚體形式存在，其中多聚體形式所占比例較高，而這一現象與我們實驗室純化得到的擬南芥AtRP1蛋白在溶液中只存在二聚體形式有明顯不同，可以推斷單子葉毛竹PeRP1與雙子葉擬南芥AtRP1在結構上可能存在差異，即毛竹RP1可能是通過二聚體或多聚體形式參與PPDK的調節，結合分子進化樹，也可推測C3植物同C4植物及單子葉同雙子葉植物中RP1蛋白空間結構也可能存在差異。SEC中PeRP1的多聚體究竟是幾聚體還需分析超速離心實驗（AUC）做進一步驗證。本研究在獲得較純的毛竹RP1蛋白后，也做了后續RP1結晶實驗，但到目前為止一直未獲得理想蛋白晶體，推測毛竹RP1在液體條件下存在不同聚合體狀態，可能直接影響到RP1均一蛋白質晶核的形成。

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Cloning,expression and purification of pyruvate,orthophosphate dikinase regulatory proteins from Phyllostachys edulis

WANG Chaoli,ZHANG Zhijun,QU Yaping,WANG Lei
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Pyruvate orthophosphate dikinase regulatory protein（PPDK-RP）is a key protein in C4photosynthesis and can modified enzyme activity of PPDK.For Phyllostachys edulis,an important economic bamboo species,cloning PPDK-RP gene and studying its functions had vital theoretical value and application for bamboo photosynthesis research.Firstly PeRP1 was successfully cloned by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）,and afterward a multiple sequence alignment and phylogenetic analysis was conducted. Then for further study the crystal structure of the PeRP protein,the recombinant expression pe-SUMO vectors of PeRP were constructed and the protein was expressed in E.coli and purified by nickle beads column and size column.Results showed that the PeRP gene contained a 1.275 kb open reading frame（ORF）coding a 425 amino acid polypeptide,which contained the typical domain of UDF299 and was predicted as a number of kinase-PPPase superfamily.The multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of PeRP revealed that Phyllostachys edulis was a typical C3monocotyledon.Expressed soluble PeRP1 protein had three forms--polymer,dimmers,and monomers in water soultion.These provided a foundation for the structure and function of RP.［Ch,7 fig.15 ref.］

botany;Phyllostachys edulis;pyruvate,orthophosphate dikinase regulatory proteins;gene cloning; prokaryotic expression;protein purification

S718.3

A

2095-0756（2015）05-0749-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.05.014

2014-11-28；

2015-01-09

國家自然科學基金資助項目（31270715）；浙江省自然科學基金資助項目（LY14C160009）

王超莉，從事生物技術與種質創新研究。E-mail：709927765@qq.com。通信作者：張智俊，副教授，博士，從事生物技術與種質創新研究。E-mail：397942805@qq.com