基于微波輻照的高效固氮微生物誘變育種概述

李劍峰 張淑卿 杜建雄 韓晗 王鎰宏

(1.貴州師范學院喀斯特生境土壤與環境生物修復研究所,貴州貴陽 550018;2.貴州財經大學,貴州貴陽 550025)

基于微波輻照的高效固氮微生物誘變育種概述

李劍峰1張淑卿1杜建雄2*韓晗1王鎰宏1

(1.貴州師范學院喀斯特生境土壤與環境生物修復研究所,貴州貴陽 550018;2.貴州財經大學,貴州貴陽 550025)

采用2400～2500MHz、中心波長為122mm的微波對固氮微生物培養液進行輻照處理。利用特定波長的微波對某些特定DNA片段的誘變作用,誘發固氮菌株固氮能力的變異。以無氮培養基篩選突變株并進行菌株固氮酶活性的測定,通過對突變株的多代定向選擇,選育出固氮能力強于原始株的穩定高效突變株。與紫外線誘變、化學誘變等誘變方式相比較,具有安全清潔、設備簡單、廉價高效的特點,可以提高固氮微生物的育種效率和降低育種成本。

固氮菌 誘變育種 微波輻照 突變株 原始菌株

以固氮微生物制成的微生物促生肥料已廣泛應用于農業生產中,在有效氮較低的耕作土壤內增產效果達22.1%～34%。我國固氮菌肥的應用已近半個世紀,取得了良好的效益。作為固氮菌肥料生產和應用的基礎,高效固氮菌株的選育是固氮菌劑研發最重要的步驟。但野生固氮菌株的固氮能力一般較弱,進行增效誘變可獲得高效固氮的突變菌株。目前誘變選育常采用紫外線輻照誘變、化學誘變等方法,其缺陷在于可能會對操作人員造成嚴重傷害,且選育出的菌株易產生回復突變,遺傳性狀不穩定[1]。而高能粒子束及激光束誘變則成本較高,效果也受設備條件和人員技術水平的影響,優良菌株的選育效率受到限制和弱化。因此如何提高固氮微生物的選育效率是科研機構和菌劑研發部門研究的重點。本文針對現有技術中的上述缺陷,介紹一種安全清潔、設備簡單、廉價高效的固氮微生物誘變育種方法,可以提高固氮微生物的育種效率和降低育種成本[2]。

1 方案簡介

1.1 輻照處理

固氮微生物的誘變處理:2400～2500MHz、中心波長122mm的微波對固氮微生物的培養菌液(OD600nm=0.5)進行微波輻照處理(根據菌種不同,輻照功率為100W-1050W,照射時間5s-240s不等),以正突變率最高的功率和時間為菌株的最佳輻照參數。

1.2 無氮培養基的配制

培養基母液配制[3]:KH2PO4(50.0 g/L),MgSO47H2O(25.0g/L),NaCl(25.0g/L),FeSO47H2O(1.0g/L),Na2MoO42H2O(1.0g/L),MnSO44H2O(1.0g/L),加1L H2O溶解后以1M NaOH調節pH為7.2,5ml培養基母液以10 g/L的甘露醇溶液定容至1L,加CaCO3粉末(0.1g/L),以2M H2SO4調pH值為6.2。固體培養基經0.45μm的微孔濾膜過濾后加瓊脂15g/L,調節pH為6.8后高壓濕熱滅菌。

2 定向篩選

在最佳輻照參數處理后的根瘤菌(800W,12s)、圓褐固氮菌(150W,178s或100W,240s)、克雷伯氏菌(250W,36s)和紅豆草根瘤菌(1050W,5s)等的菌懸液(1·104cfu.ml-1)0.2ml涂布于Winogradsky無氮固體培養基上[3]。培養7d(根瘤菌)或5d(圓褐固氮菌等)后選單菌落直徑明顯大于原始菌株的突變株,用乙炔還原法定量測定純培養物的固氮酶活性,篩選固氮酶活性明顯高于原始菌株的突變株作為初選菌株,進行進一步肥效驗證。

3 肥效驗證

將篩選出的突變株菌液施入栽培植物根部以驗證突變株的促生效果,非結瘤固氮菌接種燕麥等禾本科作物;根瘤菌接種相應的宿主植物。對固氮酶活性和植物促生效果均顯著強于出發菌株的突變株進行傳代試驗以測定其遺傳穩定性,得到固氮促生能力穩定遺傳的菌株。

4 菌種選育結果

對克雷伯氏菌(Klebsiella sp.),微波輻照的最佳參數為250W,36s。而對于紅豆草根瘤菌則為1050W,5s,不同的固氮微生物在特定輻照功率和照射時間下均可達到其最高正突變率[3]。以輻照誘變方法獲得的菌株固氮酶活性增效最高達3884.01%[4]。誘導出的高效固氮菌突變株對燕麥干重的增加量可達36.43%,較原始菌株提高137.10%,對苜蓿干重的增加量達58.54%,較原始菌株提高90.50%。對紅豆草干重的增加量達35.96%,較原始菌株提高111.76%[4]。統計分析表明,高效突變株的固氮酶活性和對植株干重的增加量顯著高出原始菌株(P＜0.05)。

5 討論與結論

目前促生微生物菌種的誘變主要采用紫外輻照、化學誘變、高能粒子束及高能電子束輻照等方法,其原理都是破壞菌體原有DNA結構和堿基序列,在其重組修復的過程中產生可遺傳的變異。紫外線和化學誘變設計的藥品對人體有強致癌性,高能粒子束輻照相對安全,但超過劑量會出現次生放射性[5]。此外高能粒子束輻照的設備昂貴,僅能在少數有條件的單位完成。相比之下微波輻照誘變選育不存在次生放射性和化學殘留,設備廉價易得,操作簡單安全,育種效率高[5],有很好的實用性和可靠性。

[1]陳力力,魯迎新.微波誘變育種井岡霉素高產菌[J].生物技術,2003,13(5):14-15.

[2]李劍峰,師尚禮,張淑卿等.一種高效固氮微生物誘變育種方法[P].甘肅:CN101899430A,2010-12-01.

[3]李劍峰,張淑卿,師尚禮,等.微波誘變選育耐藥高效溶磷苜蓿根瘤菌[J].原子能科學技術,2009b,43(12):1071-1076.

[4]李劍峰,張淑卿,師尚禮.微波誘變選育高產生長素及耐藥性根瘤菌株[J].核農學報,2009c,23(6):981-985.

[5]顏賢存,余莉莉,張鳳英.微波對枯草芽孢桿菌誘變效應的研究[J].江西農業大學學報,2005,27(6):857-860.

貴州師范學院博士基金(13BS019)項目資助。

李劍峰(1979-),男,甘肅天水人,博士,副教授,從事植物促生菌劑方面的研究。

張淑卿(1982-),女,甘肅民勤人,博士,副教授,主要從內生菌方面的研究。