白僵菌菌株的I T S序列鑒定

孟鑫睿

（哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150025）

白僵菌屬Beauveria Vuill.是全球分布的最常見(jiàn)的土壤蟲(chóng)生真菌[1]，包含有球孢白僵菌B.bassiana (Bals.-Criv.)Vuill.和布氏白僵菌B.brongniartii(Sacc.)Petch這兩種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的種類(lèi)。前者是森林生態(tài)系統(tǒng)中最為常見(jiàn)的一種昆蟲(chóng)病原真菌，屬世界性分布物種，是害蟲(chóng)蟲(chóng)口自然調(diào)節(jié)的重要因子和以菌治蟲(chóng)的重要生物防治材料[2]。因其具有致病性強(qiáng)、寄主范圍廣、對(duì)動(dòng)物植物無(wú)害、不污染環(huán)境及易培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最具開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值的蟲(chóng)生真菌之一[3]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)技術(shù)也開(kāi)始廣泛被應(yīng)用于昆蟲(chóng)病原真菌的分類(lèi)和鑒定中。ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Internal Transcribed Spacer）ITS區(qū)域序列的測(cè)定是目前真菌分類(lèi)研究的一項(xiàng)重要技術(shù)手段，對(duì)于鑒定白僵菌及研究真菌屬內(nèi)和屬間遺傳關(guān)系具有重要作用[4-8]。ITS區(qū)指的是5.8S rDNA、18S rDNA和28S rDNA之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，因其進(jìn)化相對(duì)迅速而具多態(tài)性與保守性，對(duì)此序列的檢測(cè)有助于分析菌株的遺傳關(guān)系適合較低水平的系統(tǒng)學(xué)研究，真菌的ITS序列長(zhǎng)度一般在550-750bp（堿基對(duì)）。ITS序列主要被用于對(duì)不同生物型、菌株、種、屬的分類(lèi)鑒定，也可用于研究近或低級(jí)分類(lèi)階元的系統(tǒng)發(fā)育。

本文以研究室保存的8株白僵菌菌株為研究材料，通過(guò)對(duì)其ITS序列的鑒定，明確菌株的遺傳背景，找出不同菌株間的遺傳差異，為進(jìn)一步的研究提供準(zhǔn)確可靠的研究材料。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

隨機(jī)選取8株于本實(shí)驗(yàn)室保存的球孢白僵菌菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其編號(hào)分別為Bb01-Bb08。

1.2 培養(yǎng)基

液體SDY培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母粉1.0%，葡萄糖4.0%，pH值7.0；PDA培養(yǎng)基：200g土豆去皮沸水煮20min，取汁，葡萄糖2.0%，瓊脂粉2.0%。

1.3 球孢白僵菌的DNA提取

挑取少量原菌，于SDY液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，在26℃、180r/min的搖床中，震蕩培養(yǎng)3-5d。從中吸取100μl菌液于PDA培養(yǎng)基，涂布均勻，于26℃環(huán)境培養(yǎng)3-5d。

參照朱衡等[9]的方法提取菌體總DNA，以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.4 ITS序列分析

選取真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的ITS擴(kuò)增反應(yīng)，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成，引物序列為：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’。 以提取的基因組DNA 為模板，反應(yīng)體系（25μl）如下：1μl DNA模板，12.5μl 2×PCRmix，上、下游引物各 0.5μl，用 ddH2O 補(bǔ)齊至 25μl。 PCR 反應(yīng) 條 件 ：94℃ 預(yù) 變 性 3min；94℃變 性 30sec，55℃ 退 火 30sec，72℃ 延 伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸 10 min；4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAman軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并建立系統(tǒng)同源樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

所提取DNA均在加樣孔附近呈現(xiàn)一致密亮帶，基本無(wú)降解。所提DNA較好，可以用于擴(kuò)增反應(yīng)。以提取的白僵菌菌株的DNA為模板，利用上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增后，對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1示PCR條帶與預(yù)期目的條帶（600bp左右）大小吻合。

2.2 ITS序列分析

利用DANMAN的多序列比對(duì)，對(duì)8個(gè)供試菌株的ITS片段進(jìn)行比對(duì)拼接，經(jīng)NCBI序列比對(duì)，證實(shí)這8個(gè)菌株都為球孢白僵菌菌株。

根據(jù)聚類(lèi)分析構(gòu)建系統(tǒng)同源樹(shù)（圖2）。結(jié)果表明8株球孢白僵菌菌株的ITS序列同源性達(dá)到99%。除Bb01、Bb08存在較小差異，其他6株球孢白僵菌的ITS序列完全一致。

3 討論

一些球孢白僵菌菌株在形態(tài)、生物學(xué)等方面非常相似，如何對(duì)這些菌株進(jìn)行鑒定和區(qū)分,是檢疫實(shí)踐中面臨的首要問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)的發(fā)展，在球孢白僵菌的分子鑒定方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。選擇合適的靶序列至關(guān)重要。

核糖體DNAITS區(qū)是核糖體DNA中介于18S和28S之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括ITS1和ITS2兩段序列，它們?cè)谏镞M(jìn)化過(guò)程中顯示種的特征，在種內(nèi)具有高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異，是最廣泛應(yīng)用分類(lèi)鑒定的理想遺傳標(biāo)記。

本研究采用球孢白僵菌ITS區(qū)的通用引物擴(kuò)增種群的ITS區(qū)并進(jìn)行序列測(cè)定，長(zhǎng)度分別為500bp左右。各球孢白僵菌序列長(zhǎng)度均包含18S、28S以及5.8S基因的全部序列，通過(guò)ITS區(qū)序列比對(duì)，可以探討菌株間在遺傳上基因的距離，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)所選菌株同源性較一致。大部分同源性可達(dá)達(dá)100%。有關(guān)球孢白僵菌ITS區(qū)序列的測(cè)定以及分析，還有大量的后續(xù)工作如的進(jìn)化關(guān)系、不同菌株間的鑒定方法等等需要進(jìn)一步研究。通過(guò)對(duì)8株白僵菌的ITS序列鑒定，可為球孢白僵菌不同菌株間的遺傳多樣性積累重要的數(shù)據(jù)，同時(shí)對(duì)形態(tài)相似的菌株鑒定有積極作用。

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