HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2在稽留流產患者絨毛組織中的表達

王 玲，趙衛東

HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2在稽留流產患者絨毛組織中的表達

王 玲1，2，趙衛東1

目的探討低氧誘導因子（HIF-1α）、血管內皮生長因子（VEGF）及VEGF受體（VEGFR-1、VEGFR-2）在稽留流產（MA）絨毛組織中的表達及臨床意義，探究MA發生中低氧對腦血管生成的影響。方法免疫組化SP法檢測35例MA患者（研究組）以及32例正常早孕行人工流產者（對照組）絨毛組織的HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的表達水平，并對結果進行統計分析。結果研究組與對照組絨毛組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2均有表達。研究組中HIF-1α表達高于對照組（P＜0.05），VEGF、VEGFR-2表達明顯低于對照組（P＜0.05）。對照組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2表達呈正相關性（P＜0.05），研究組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-2表達呈負相關性（P＜0.05），與VEGFR-1表達無相關性。結論 HIF-1α在MA絨毛組織中表達上升，通過調節VEGF、VEGFR-2基因的轉錄，胎盤絨毛血管的生成減少，可能是MA發生的重要原因。

稽留流產；低氧誘導因子；血管內皮生長因子；血管內皮生長因子受體

稽留流產（missed abortion，MA）也稱過期流產，是指妊娠20周之前胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內未能及時自然排出，是自然流產的一種特殊類型。引起MA的原因眾多，但確切機制尚不明確。在早期妊娠中絨毛膜的絨毛血管化與胚胎發育密切相關，在此過程中血管的缺陷會導致一些并發癥。在妊娠早期，胚胎的發育和胎盤的形成是在一個相對低氧的情況下完成的，低氧對滋養層細胞相關的侵襲和分化過程起重要的調節作用［1］。許多調節因子如低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、VEGF受體（vascular endotheli-al growth factor receptor-1、2，VEGFR-1、VEGFR-2）與早孕胎盤血管的生成和發展關系密切。該研究檢測MA患者絨毛組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2分子的表達情況及相互關系，從血管生成的角度對MA的發生進行研究。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2013年6月～2013年12月在安徽省婦幼保健院婦科住院的MA患者35例為研究組，孕婦年齡20～35（29.40±4.52）歲，孕周7～10（8.40±2.34）周。篩選標準：①年齡20～35歲，胚胎停止發育的時間在停經7～10周；②TORCH檢測、抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibody，ACA）、抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）、抗子宮內膜抗體（endomethal antibody，ENA）檢測均為陰性；③本次妊娠期間未服用保胎藥物，無毒物接觸史；④無原發性高血壓、糖尿病、慢性腎炎、甲狀腺功能亢進等病史；⑤宮頸分泌物檢查支原體、衣原體為陰性。納入標準：經B超及β-hCG動態監測證實為MA。選取因非意愿妊娠在本院門診要求行人工流產的早孕婦女32例為對照組，孕婦年齡21～36（28.30±5.53）歲，孕周7～10（7.90±2.16）周。篩選標準：月經規律，獲取標本前3個月未使用過甾體類激素，無異常孕育史，無原發性高血壓、糖尿病、慢性腎炎、甲狀腺功能亢進等病史。納入標準：經B超檢查提示其為宮內妊娠，可見胚胎心管搏動，但其要求行“人工流產”的健康孕婦。兩組患者的年齡、孕產次差異無統計學意義。本研究經研究對象知情同意并簽字。

1.2 標本的采集及處理在無菌條件下采用負壓（53.3～66.7 kPa）抽吸方法吸出的絨毛組織，迅速在生理鹽水中漂洗后，放入10%甲醛固定液固定24 h，石蠟包埋，制成4 μm厚連續切片，黏附于防脫臘的載波片。按試劑盒說明書檢測HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的表達。常規HE染色法觀察兩組絨毛及血管形態。

1.3 免疫組織化學檢測方法采用免疫組化SP法，按照試劑盒說明書操作。采用辣根酶標記鏈酶卵白素免疫組化法。4 μm厚切片，60℃烤箱過夜后脫蠟至水，酒精梯度脫水后蒸餾水洗；加入檸檬酸抗原高壓修復，高壓鍋冒汽后2 min，室溫冷卻，3%的過氧化氫溶液封閉10 min；加一抗抗體，4℃冰箱過夜，PBS沖洗；加生物素標記的二抗，PBS沖洗；加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹脂封片。用PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.4 實驗試劑兔抗人單克隆抗體HIF-1α、兔抗人單克隆抗體VEGF、兔抗人單克隆抗體VEGFR-2原液、三部法免疫組化試劑均購自北京中杉金橋公司；兔多克隆抗體VEGFR-1原液購自武漢博士德公司。

1.5 結果判定每張切片隨機選取5個視野（× 400），鏡下見黃色顆粒為陽性細胞，陽性產物應分布于細胞質。依照細胞陽性著色程度（抗原含量）可分為：無著色（0分），淡黃色顆粒（1分），淺褐色顆粒（2分），深褐色顆粒（3分）。著色細胞數以每張切片陽性細胞占細胞總數的百分比表示：沒有陽性細胞（0分），＜10%（1分），11%～50%（2分），51%～80%（3分），＞80%（4分）。采用積分綜合計量，計算公式為：總數值＝著色強度×著色細胞數；整個得分從0～12分，根據最終得分結果分為3個等級：0分，無反應；1～4分，低表達；＞4分，高表達。至少隨機觀察5～10個高倍鏡視野［2］。

1.6 統計學處理應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法分析，計量資料同一因子組間的比較采用兩組獨立樣本的t檢驗分析，蛋白表達相關性分析采用Spearman秩相關方法，使用GraphPad Prism 5.0軟件繪制相關統計圖。

2 結果

2.1 研究組與對照組臨床特征χ2檢驗和Fisher確切概率法分析兩組患者年齡、孕周差異無統計學意義。研究組陰道流血明顯多于對照組，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。研究組既往有妊娠史多于對照組，組間比較差異無統計學意義。見表1。

表1 臨床特征

2.2 兩組絨毛組織中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達情況采用t檢驗分析表達情況，HIF-1α在兩組絨毛細胞滋養細胞、合體滋養細胞的細胞質和細胞核、血管內皮細胞周圍的間質細胞質中均有表達，在研究組表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。VEGF、VEGFR-2在兩組絨毛細胞滋養細胞、合體滋養細胞、血管內皮細胞及周圍間質細胞質中均有表達，在研究組中明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。VEGFR-1在兩組絨毛細胞滋養細胞、合體滋養細胞質中均有表達，兩組中表達差異無統計學意義。見圖1、2，表2。

2.3 HIF-1α與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2表達的相關性采用Spearman秩相關方法分析相關性，對照組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達呈正相關性（P＜0.05）。研究組中HIF-1α與VEGFR-2呈負相關性（P＜0.05），與VEGFR-1無明顯相關性。見表3、4。

表2 兩組中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達比較（±s）

表2 兩組中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達比較（±s）

因子對照組（n＝32）研究組（n＝35）t值P值HIF-1α2.57±0.423.57±0.852.160.043 VEGF6.14±0.713.14±1.182.470.019 VEGFR-12.24±0.402.31±0.270.930.360 VEGFR-24.04±0.501.85±0.393.180.003

表3 對照組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達相關性分析

3 討論

HIF是一種異質二聚體蛋白，由α亞基和β亞基構成。HIF-1α常氧條件下經過泛素蛋白水解途徑降解，低氧環境下其降解過程受抑制，HIF-1α蛋白迅速累積，并與HIF-1β聚合，形成有活性的HIF-1蛋白，調節其靶基因的轉錄［3］。HIF-1α特異性作用于低氧反應通路，調節活性。研究［4］表明HIF-1α可以通過誘導血管生成而發揮作用。本研究顯示在研究組及對照組絨毛組織中HIF-1α均有表達，提示早孕低氧下HIF-1α發揮了重要作用。研究［5］表明，HIF-1α上升引起滋養細胞分化為侵入型受抑制，滋養細胞侵入子宮螺旋動脈變淺，胎盤血管灌注減少引起妊娠失敗。本研究表明HIF-1α在MA中表達上升，可能與MA中嚴重低氧誘導HIF-1α有關。

表4 研究組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達相關性分析

VEGF被認為是最強大的血管生成啟動子，VEGFR-1、VEGFR-2是VEGF的兩個高親和力受體；VEGFR-2是血管生成主要因子，與VEGF結合后發揮促進血管生成的作用。研究［6］顯示，敲除VEGFR-1基因的小鼠胚胎，內皮細胞過度增生，血管官腔阻塞，形成過多無功能血管，胚胎死亡，提示VEGFR-1具有負性調節作用。早孕時血管生成的正負因子處于平衡狀態，這個平衡促進血管的生成并維持正常的妊娠。妊娠早期胎盤血管的形成在VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2的指導下進行［7］，研究［8］也表明早孕胎盤絨毛中VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2在血管生成中起作用。本研究中研究組和對照組絨毛組織中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2都有表達，且研究組中的VEGF、VEGFR-2表達明顯低于對照組，提示MA中血管生成的正性因子受到抑制，負性因子無明顯改變，導致胎盤血管生成減少引起妊娠失敗。研究［9］表明，MA中VEGF、VEGFR-2表達明顯下降。

本研究中對照組絨毛組織中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2呈正相關性，表明低氧通過HIF-1α上調VEGF表達，胎盤絨毛血管網絡逐漸形成并促進妊娠的繼續。研究組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-2呈負相關性，與VEGFR-1無明顯的相關性。研究［10］表明，MA中HIF-1α表達上升，VEGF下降，HIF-1α與VEGF呈負相關性，這與本研究結果一致。為VEGF引起MA的關鍵作用的假設提供了支持。推測在MA這個嚴重低氧的環境下，HIF-1α表達上升，HIF-1α可能抑制了VEGF的表達，血管生成的平衡被打破，正性因子減少，負性因子無明顯改變，胎盤絨毛血管生成減少，早期胚胎不能獲得足夠的氧氣和營養物質，導致MA的發生。

綜上所述，低氧程度不同造成HIF-1α、VEGF、 VEGFR-1、VEGFR-2之間關系失衡引起血管發育的異常可能是造成MA的重要原因。MA中HIF-1α引起VEGF、VEGFR-2升高的具體機制有待進一步研究，明確MA病因并盡早診斷治療。

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The expression and significance of HIF-1α，VEGF，VEGFR-1 and VEGFR-2 in missed abortion patients

Wang Ling1，2，Zhao Weidong1
（1Dept of Obstetrics and Gynaecology，The Affiliated Provincial Hosptial of Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Obstetrics，Anhui Province Maternity and Child Care，Hefei 230001）

ObjectiveTo study the expressions and clinical significance of hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α），vascular endothelial growth factor（VEGF），vascular endothelial growth factor receptor-1（VEGFR-1）and vascular endothelial growth factor receptor-2（VEGFR-2）in the villi tissue of patients with missed abortion（MA）and early pregnant women.To explore the influence of hypoxia on placenta angiogenesis in missed abortion.MethodsTo detect the expression of HIF-1α，VEGF，VEGFR-1 and VEGFR-2 in the villi tissue of 35 cases of MA patients（research group）and 32 early pregnant women（control group）who underwent induced abortion surgery by immunohistochemistry，and theResultswere statistical analysis.ResultsHIF-1α，VEGF，VEGFR-1 and VEGFR-2 were expressed both in the villi tissue of research group and the control group.The expression of HIF-1α was higher in the research group than in the control group（P＜0.05）.The expressions of VEGF，VEGFR-2 were significantly lower in the research group than in the control group（P＜0.05）；the expression of HIF-1α was positively correlated with VEGF，VEGFR-1and VEGFR-2 in the control group，and the expression of HIF-1α was negatively correlated with VEGF and VEGFR-2 in the research group（P＜0.05），which had no correlation with VEGFR-1.ConclusionThe expression of HIF-1α in the villi tissue of MA is up-regulated，the blood vessel formation of placenta decreases by adjusting the VEGF and VEGFR-2 genes transcription，which maybe is the important causes for MA.

HIF-1α；VEGF；VEGFR-1；VEGFR-2；missed abortion

R 714.21

1000－1492（2015）02－0227－05

2014－11－13接收

安徽省科技攻關計劃項目（編號：08010302101）

1安徽醫科大學附屬省立醫院婦產科，合肥 2300012安徽省婦幼保健院產科，合肥 230001

王 玲，女，碩士研究生；趙衛東，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：victorzhao＠163.com