丙戊酸鈉聯(lián)合全反式維甲酸促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞衰老的發(fā)生

尤青葉，馮定慶，凌 斌，3，張紅麗，李 兵，伍嬌嬌，趙婷婷

丙戊酸鈉聯(lián)合全反式維甲酸促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞衰老的發(fā)生

尤青葉1，馮定慶2，凌 斌1，3，張紅麗1，李 兵1，伍嬌嬌1，趙婷婷1

目的研究丙戊酸鈉（VPA）聯(lián)合全反式維甲酸（ATRA）誘導(dǎo)子宮頸癌細(xì)胞衰老作用，并探討其分子機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、VPA組、ATRA組、VPA＋ATRA組，采用3 mmol／L VPA、1 μmol／L ATRA單獨(dú)或聯(lián)合作用于人子宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞，對(duì)照組僅加溶媒；采用CellTiter 96?AQueous法檢測(cè)細(xì)胞增殖；β-半乳糖苷酶化學(xué)染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老；Q-PCR和Western blot法分別檢測(cè)衰老相關(guān)基因P16、P63、hTERT的mRNA和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果VPA對(duì)HeLa及SiHa細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用，與ATRA聯(lián)合抑制效果明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥（P＜0.05）；β-半乳糖苷酶染色顯示，VPA＋ATRA組衰老細(xì)胞比例顯著增加，與對(duì)照組及VPA組、ATRA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；QPCR和Western blot法結(jié)果顯示，VPA單獨(dú)和聯(lián)合ATRA可上調(diào)P16、P63的表達(dá)，降低hTERT的表達(dá)，且聯(lián)合用藥優(yōu)于單獨(dú)用藥及對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論 VPA聯(lián)合ATRA可抑制子宮頸癌細(xì)胞增殖，上調(diào)P16和P63的表達(dá)，下調(diào)hTERT的表達(dá)，可能是其誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的分子機(jī)制。

子宮頸癌；丙戊酸；維甲酸；細(xì)胞衰老

近年來子宮頸癌的發(fā)病率有明顯上升和年輕化趨勢(shì)，發(fā)病率以每年2%～3%的速度增長(zhǎng)［1］。早期子宮頸癌患者可采用手術(shù)治療，而晚期患者主要以鉑類化療為主，但毒副作用大，患者易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，患者生存率大大降低［2－3］。丙戊酸鈉（valproate acid，VPA）是一種傳統(tǒng)的抗癲癇藥物，同時(shí)也是一種組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑，高效、安全、低毒、可口服的特點(diǎn)使其極具臨床前景。全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）是維生素A的生物活性代謝產(chǎn)物，與其受體結(jié)合，具有促進(jìn)上皮細(xì)胞分化成熟的作用，已作為一種誘導(dǎo)分化劑用于臨床腫瘤的治療。研究［4-5］證實(shí)VPA聯(lián)合ATRA可使子宮頸癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化，但細(xì)胞凋亡增加不明顯。該研究進(jìn)一步分析VPA聯(lián)合ATRA的抗子宮頸癌作用，觀察其對(duì)細(xì)胞衰老的影響并探討其可能的分子機(jī)制，為尋求新的子宮頸癌治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑VPA購(gòu)自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，用PBS稀釋成600 mmol／L的儲(chǔ)存液，－20℃保存；ATRA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用DMSO稀釋成833 mmol／L的儲(chǔ)存液，－20℃保存；CellTiter 96?AQueous購(gòu)自美國(guó)Promega公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；P16、P63、hTERT抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；相應(yīng)蛋白的辣根酶標(biāo)記二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；ECL-增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)自瑞士羅氏公司；BIORAD化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組人子宮頸癌細(xì)胞株HeLa與SiHa購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%小牛血清、100 U／ml青霉素和100 U／ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2孵箱孵育，48 h換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、VPA組、ATRA組、VPA＋ATRA組。各組藥物終濃度為VPA 3 mmol／L、ATRA 1 μmol／L。觀察48 h。

1.3 CellTiter 96?AQueous法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa及SiHa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化制成細(xì)胞懸液，以1 500個(gè)／孔的密度接種于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，各用藥組分別加入相應(yīng)的藥物，對(duì)照組僅加溶媒，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于24、48、72、96 h加CellTiter 96?AQueous工作液，1 h后酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（optical density，OD）值。生長(zhǎng)抑制率（%）＝（用藥組OD值－對(duì)照組OD值）／對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞混懸液，以1×106個(gè)／ml的密度接種于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，各用藥組分別加入相應(yīng)的藥物，對(duì)照組用溶媒處理。孵育48 h后吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min后吸除固定液，PBS洗滌3次，加入1 ml染色工作液，37℃孵育過夜，第2天取出用PBS洗滌，再加1次PBS保留，顯微鏡下觀察并拍照。衰老指數(shù)（%）＝（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.5 Q-PCR法檢測(cè)P16、P63、hTERT mRNA的表達(dá)收集細(xì)胞加入TRIzol，提取總RNA，按照Prime-Script?RT操作說明配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。P16、P63、hTERT引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1（PCR引物序列檢測(cè)的P63為TAP63亞型）。按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)，按照2－ΔCt即2－（目的基因Ct－管家基因Ct）計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6 Western blot法檢測(cè)子宮頸癌細(xì)胞株中P16、P63、hTERT的表達(dá)收集細(xì)胞加入RIPA裂解細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。分別配制6%和8%的SDS-PAGE電泳凝膠，恒壓電泳分離；半干法恒壓15 V轉(zhuǎn)膜30 min；4℃搖床上封閉過夜。加入一抗P16（1∶1 000）、P63（1∶500）、hTERT（1∶1 000）和內(nèi)參照GAPDH抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜；分別加入相應(yīng)的二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，ECL-增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑顯色，BIORAD化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 VPA聯(lián)合ATRA抑制子宮頸癌細(xì)胞增殖CellTiter 96?AQueous法檢測(cè)結(jié)果顯示VPA和ATRA對(duì)HeLa、SiHa細(xì)胞均有增殖抑制作用，兩藥聯(lián)合則具有協(xié)同／相加的作用，與VPA組、ATRA組及對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 VPA聯(lián)合ATRA促進(jìn)HeLa、SiHa細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示，對(duì)照組HeLa細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽(yáng)性率為（5.3±1.61）%，SiHa細(xì)胞為（3.6±1.56）%；VPA＋ATRA組衰老指數(shù)顯著增加，其中HeLa細(xì)胞為（27.5±4.46）%，SiHa細(xì)胞為（35.33±4.55）%，與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝106.7，P＜0.05）。提示VPA聯(lián)合ATRA能夠顯著促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞的衰老，見圖2。

2.3 衰老相關(guān)基因mRNA的表達(dá)變化Q-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示HeLa、SiHa細(xì)胞經(jīng)藥物處理48 h后，與對(duì)照組比較，VPA可上調(diào)P16、P63的mRNA表達(dá)水平（F＝39.51，P＜0.05）；與對(duì)照組比較，VPA＋ATRA組SiHa細(xì)胞中P16的表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），HeLa細(xì)胞中P16、P63表達(dá)水平和SiHa細(xì)胞中P63表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01）；VPA＋ATRA組與VPA組、ATRA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但SiHa細(xì)胞中P16表達(dá)水平VPA＋ATRA組與VPA組、ATRA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，HeLa、SiHa細(xì)胞中VPA組和VPA＋ATRA組均能降低hTERT mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；VPA＋ATRA組強(qiáng)于VPA組、ATRA組（P＜0.01）。見圖3。

2.4 P16、P63及hTERT的蛋白表達(dá)水平變化與各基因mRNA表達(dá)變化一致，HeLa、SiHa細(xì)胞經(jīng)VPA單獨(dú)和聯(lián)合ATRA處理后，P16、P63的蛋白表達(dá)水平明顯升高，而hTERT的蛋白表達(dá)水平顯著降低，VPA＋ATRA組與對(duì)照組及VPA組、ATRA組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝40.56，P＜0.05），見圖4。

3 討論

在多種腫瘤中存在的結(jié)構(gòu)或表達(dá)異常、組蛋白乙酰化水平異常，從而導(dǎo)致了特定抑癌基因的表達(dá)抑制。研究［6］顯示HDAC抑制劑能夠與HDAC特異性結(jié)合并抑制其活性，促進(jìn)組蛋白的乙酰化修飾，上調(diào)相關(guān)抑癌基因的表達(dá)，在多種腫瘤中顯示了抗腫瘤作用。HDAC抑制劑可能通過多種途徑起到抗腫瘤作用，包括調(diào)控多種細(xì)胞凋亡途徑及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及其穩(wěn)定性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、分化或細(xì)胞凋亡［7］，也可能抑制腫瘤血管的生成，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。除了內(nèi)在的抗腫瘤活性，HDAC抑制劑還可增加對(duì)傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物和腫瘤細(xì)胞放射的敏感性。研究［4－5］表明，VPA是一種HDAC抑制劑，聯(lián)合ATRA可通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化而發(fā)揮抗子宮頸癌作用。本研究顯示VPA與ATRA聯(lián)合用藥可促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞衰老。

既往研究［9］顯示，VPA聯(lián)合ATRA可調(diào)控多種基因表達(dá)，包括多種抑癌基因。本研究顯示兩藥聯(lián)合上調(diào)P16和P63的表達(dá)。P16是目前已經(jīng)明確的一種重要的抑癌基因，其主要通過p16-cyclinD／CDK-RB途徑對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。研究［10］顯示細(xì)胞發(fā)生衰老時(shí)，P16表達(dá)明顯升高，當(dāng)年輕的細(xì)胞中導(dǎo)入P16基因細(xì)胞可出現(xiàn)衰老表型，提示P16是細(xì)胞壽限的關(guān)鍵調(diào)控基因之一。Duan et al［11］以P16正反義載體分別轉(zhuǎn)染年輕的人成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P16過表達(dá)抑制了RB磷酸化從而引起細(xì)胞早衰而其反義載體轉(zhuǎn)染可以延緩細(xì)胞衰老。說明P16的積累不是衰老的結(jié)果而是衰老的誘因。P63是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的P53蛋白家族成員，其在上皮細(xì)胞發(fā)育，基因中兩個(gè)不同的啟動(dòng)子，將其翻譯產(chǎn)物分為兩種亞型，即反式激活域完整的TAP63和反式激活域N端截短的△NP63。TAP63轉(zhuǎn)錄激活（TA）結(jié)構(gòu)域與P53的TA結(jié)構(gòu)域具有同源性，可以激活P53的下游基因，具有與P53相似的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的作用。Truong et al［12］認(rèn)為TAP63具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞衰老的作用。目前研究［13］表明，HDAC抑制劑所誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老部分是由P63介導(dǎo)的，這可能與不同細(xì)胞系特性和不同類型HDAC抑制劑作用的差別有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生衰老是由很多因素參與在內(nèi)的。hTERT是人類端粒酶蛋白的催化亞單位，其表達(dá)水平與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。本研究顯示VPA聯(lián)合ATRA誘導(dǎo)衰老的子宮頸癌細(xì)胞中hTERT表達(dá)水平顯著降低。hTERT能激活端粒酶，端粒酶是細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒延長(zhǎng)的一種酶，其能延長(zhǎng)縮短的端粒，當(dāng)端粒酶合成端粒難以彌補(bǔ)縮短的端粒時(shí)，端粒將進(jìn)行性縮短，從而誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞衰老。有研究［14］提示hTERT在腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞等永生化細(xì)胞中的表達(dá)水平很高，防止細(xì)胞因端粒縮短而發(fā)生細(xì)胞衰老、凋亡。由此可見，端粒、端粒酶在細(xì)胞衰老和腫瘤的發(fā)生中具有重要的作用，有可能成為腫瘤診斷的重要指標(biāo)，同時(shí)，也可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

［1］ 莫小亮，羅殿中.2012年美國(guó)宮頸癌篩查新指南解讀［J］.腫瘤防治研究，2014，41（2）：188－92.

［2］ Klopp A H，Eifel P J.Chemoradiotherapy for cervical cancer in 2010［J］.Curr Oncol Rep，2011，13（1）：77－85.

［3］ Tewari K S，Monk B J.Recent achievements and future developments in advanced and recurrent cervical cancer：trials of the Gynecologic Oncology Group［J］.Semin Oncol，2009，36（2）：170－80.

［4］ Feng D，Cao Z，Li C，et al.Combination of valproic acid and ATRA restores RARβ2 expression and induces differentiation in cervical cancer through the PI3K／Akt pathway［J］.Curr Mol Med，2012，12（3）：342－54.

［5］ Feng D，Wu J，Tian Y，et al.Targeting of histone deacetylases to reactivate tumour suppressor genes and its therapeutic potential in a human cervical cancer xenograft model［J］.PLoS One，2013，8（11）：e80657.

［6］ Tassara M，D?hner K，Brossart P，et al.Valproic acid in combination with all-trans retinoic acid and intensive therapy for acute myeloid leukemia in older patients［J］.Blood，2014，123（26）：4027－36.

［7］ Gan C P，Hamid S，Hor S Y，et al.Valproic acid：growth inhibition of head and neck cancer by induction of terminal differentiation and senescence［J］.Head Neck，2012，34（3）：344－53.

［8］ Sakajiri S，Kumagai T，Kawamata N，et al.Histone deacetylase inhibitors profoundly decrease proliferation of human lymphoid cancer cell lines［J］.Exp Hematol，2005，33（1）：53－61.

［9］ Trus M R，Yang L，Suarez Saiz F，et al.The histone deacetylase inhibitor valproic acid alters sensitivity towards all trans retinoic acid in acute myeloblastic leukemia cells［J］.Leukemia，2005，19（7）：1161－8.

［10］Min E Y，Kim I H，Lee J，et al.The effects of fucodian on senescence are controlled by the p16INK4a-pRb and p14Arf-p53 pathways in hepatocellular carcinoma and hepatic cell lines［J］.Int J Oncol，2014，45（1）：47－56.

［11］Duan J，Zhang Z，Tong T.Senescence delay of human diploid fibroblast induced by anti-sense p16INK4a expression［J］.J Biol Chem，2001，276（51）：48325－31.

［12］Truong A B，Khavari P A.Control of keratinocyte proliferation and differentiation by P63［J］.Cell Cycle，2007，6（3）：295－9.

［13］曹振平，馮定慶，徐嶸嶸.丙戊酸鈉聯(lián)合全反式維甲酸對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷機(jī)制研究［J］.腫瘤，2010，30（10）：827－32.

［14］李 敏，周 穎，凌 斌.端粒及端粒酶活性的調(diào)控機(jī)制［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2010，7（2）：176－9.

Studies on promoting cellular senescence by VPA combined with ATRA in cervical cancer cells

You Qingye1，F(xiàn)eng Dingqing2，Ling Bin1，3，et al（1Dept of Obstetrics and Gynecology，2Key Laboratory of Molecular Medicine，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；
3Dept of Obstetrics and Gynecology of China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100086）

ObjectiveTo study valproate acid（VPA）combined with all-trans retinoic acid（ATRA）induced cervical cancer cells senescence，and explore its mechanism.MethodsThe experiment is divided into the control group，the VPA group，ATRA and VPA＋ATRA groups.HeLa and SiHa cells were treated with combinated use of 3 mmol／L VPA，1 μmol／L ATRA or respectively.The control group was treated with vehicle only.Using CellTiter 96?Aqueous cell proliferation assay to detect the inhibitory rate of proliferation.Apply β-galactosidase staining method to observe the senescence.The mRNA expressions of P16，P63 and hTERT were detected using Q-PCR and its protein expressions were determined using Western blot.ResultsThe proliferation of HeLa and SiHa cells were significantly inhibited by VPA.The effect of VPA combinated with ATRA was stronger than individual treatment（P＜0.05）.β-galactosidase staining showed that β-galactosidase staining rate was up-regulated after VPA combined with ATRA in cervical cancer HeLa and SiHa cells，the difference was significant compared with control group and individual group（P＜0.05）.Q-PCR and Western blot showed that VPA enhanced the mRNA and protein expression of P16，P63 and reduced the expression of hTERT.The efficacy was more powerful in combination therapy group（P＜0.05）.ConclusionVPA combined with ATRA can inhibit the growth of cervical cancer cell lines.The effect of inducing cervical cancer cells senescence may be related with up-regulation of P16，P63 and downregulation of hTERT.

cervical cancer；valproic acid；tretinoin；cell senescence

R 737.33

1000－1492（2015）02－0135－05

2014－11－03接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81372777、81372779、81072127）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1婦產(chǎn)科、2分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 2300013衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100086

尤青葉，女，碩士研究生；凌 斌，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lingbin.ling＠gmail.com