尿液POU4F2基因甲基化對膀胱尿路上皮癌早期診斷的意義

王永強，于 源，安 丹，姜會玲，林友成，吳 松，蔡志明

尿液POU4F2基因甲基化對膀胱尿路上皮癌早期診斷的意義

王永強1，2，于 源3，安 丹3，姜會玲1，林友成4，吳 松2，蔡志明1，2

目的尋找在中國人群中具有高敏感性、高特異性的膀胱癌甲基化標志物，以應用于膀胱癌的尿液診斷。方法先用T24細胞系篩選8種文獻報道的膀胱癌甲基化標志物，再利用甲基化特異性熒光定量PCR（qMSP）技術分別在28例膀胱癌患者、10例尿路結石伴感染患者和30例健康志愿者尿液樣品中檢測篩選成功的4種甲基化標志物，計算出不同組合的敏感性和特異性。結果PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的敏感性分別為46.43%、92.86%、39.29%、46.43%，特異性分別為95.00%、97.50%、97.50%、100.00%，最優的診斷標志物為POU4F2（敏感性92.86%、特異性97.50%）。結論 應用qMSP技術，以POU4F2為甲基化標志物在尿液中檢測膀胱癌可能會成為一種臨床可用的診斷方式。

膀胱癌；qMSP；甲基化；診斷

膀胱癌發病率在全身腫瘤發病率中居第九位，嚴重危害人類的健康［1］。由于早期膀胱癌常不顯示癥狀，不易發現，因而早診斷、早治療對膀胱癌患者的預后具有極大的幫助。開發高靈敏、高特異性的膀胱癌無創檢查是膀胱癌檢測和監控手段的發展方向。膀胱癌的發生與基因組水平的改變相關，同時亦發生表觀遺傳學上的改變如DNA甲基化和組蛋白修飾等［2－4］。DNA甲基化異常可通過影響染色質結構及癌基因和抑癌基因的表達而參與膀胱癌的形成。因此，特定基因的DNA甲基化可作為生物標志物診斷和監測膀胱癌。甲基化特異性PCR（methylation-specific polymerase chain reaction，MSP）是目前檢測DNA甲基化最敏感的技術，能發現0.1%的甲基化DNA（＞50 pg）。近些年產生的甲基化特異性熒光定量PCR（quantitative methylationspecific polymerase chain reaction，qMSP）技術是實時定量基因擴增熒光檢測系統與MSP技術的結合，利用qMSP技術檢測膀胱癌的方法有諸多報道［5－8］，但研究主要局限于歐美人種，且不同種族間的基因甲基化情況差異較大。該研究利用qMSP技術在中國人尿液中檢測多種腫瘤標志物，以期達到早期無創診斷膀胱癌的目的。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2013年2月～2014年4月在安徽醫科大學第一附屬醫院泌尿外科、中山大學腫瘤醫院泌尿外科、南方醫科大學珠江醫院泌尿外科膀胱癌患者尿液樣品28份作為膀胱癌組，尿路結石伴感染患者尿液樣品10份作為尿感染組，健康志愿者尿液樣品30份作為正常組，臨床資料見表1。尿液樣品均為中段晨尿，采集后立即用低溫離心機4℃，2 000 r／min離心15 min后，去上清液，留沉淀進行DNA提取。患者及其家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 主要試劑天根組織／血液DNA提取試劑盒、天根微量樣品基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；dsDNA HS分析試劑盒、實時熒光定量PCR系統、96孔PCR儀、核酸蛋白定量儀2.0（美國Life Technologies公司）；DNA甲基化試劑盒（美國ZYMO Research公司）；TaKaRa RT-PCR試劑盒、TaKaRa premix taq ver 2.0 plus dye（大連寶生物工程有限公司）；低溫高速離心機（BECKMAN 64R）（美國Beckman Coulter公司）。T24膀胱癌細胞系由深圳北大醫院中心實驗室贈予。引物序列參考文獻［5－8］，見表2。

1.3 方法

1.3.1實驗組與對照組 實驗組為膀胱癌患者，記為BC；對照組為尿路結石伴感染患者及健康志愿者，分別記為U和N。

1.3.2DNA提取 采用天根微量樣品基因組DNA提取試劑盒對尿沉渣進行DNA提取，提取流程參照試劑盒說明書。采用天根組織／血液DNA提取試劑盒對T24細胞進行DNA提取，提取流程參照試劑盒說明書。

1.3.3樣品檢測

1.3.3.1濃度檢測 檢測方法按照Quant-it dsDNA HS Assay Kit的說明書中步驟進行。注意每日首次使用Qubit時，均需要制作標準曲線，且要用2 μl standard2＃作為陽性對照，檢驗標準曲線的準確性，只有當standard2＃檢測的濃度在下面范圍內標準曲線才能使用。Qubit HS陽性對照（standard2＃）檢測濃度范圍9.5～10.5 ng／μl。

1.3.3.2樣品完整性檢測方法 根據Qubit定量的濃度，取約50 ng DNA，與3 μl溴酚藍混合，補水至10 μl后，全部加入到1%瓊脂糖檢測膠的膠孔中，樣品應同時包括2條分子量標準：λ-Hind Ш digest（上樣量2 μl）及D2000（上樣量6 μl）。電泳條件：電壓150 V電泳40 min。將電泳完成的膠塊置于凝膠成像儀中拍照保存。拍照時注意膠圖背景較暗，膠孔要清晰。選擇DNA總量＞500 ng，片段大小＞10 000 bp的樣本進行后續實驗。

1.3.4Bisulfite處理 Bisulfite處理的樣本起始量為200 ng，具體實驗方法和注意事項根據ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-GoldTMKit的說明書進行操作，純化時用20 μl的M-Elution Buffer洗脫DNA。Bisulfite反應體系：CT Conversion Reagent 130 μl，DNA模板200 ng，滅菌雙蒸水補足150 μl。所用儀器：96-Well GeneAmp PCR System 9700。反應條件：98℃、10 min，65℃、2.5 h，4℃維持。

1.3.5甲基化引物篩選 以經Bisulfite處理的T24細胞系DNA為模版，選取各個引物分別進行PCR。反應體系：模版30 ng、TaKaRa?premix taq 25 μl、上下游引物各1 μl、滅菌雙蒸水補足至50 μl。反應條件：94℃預變性5 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃30s，擴增40個循環，72℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖電泳分析。沒有條帶的視為引物篩選失敗，選取ALU-C4作為內參，PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154作為甲基化標志物進行后續實驗。見圖1。

1.3.6qMSP檢測 對經Bisulfite處理的DNA樣本進行qMSP，每個樣本檢測ALU-C4、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154 5對引物。反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTM II（2×）10 μl、引物（10 μM）2 μl、ROX Reference Dye（50×）0.4 μl、DNA模板2 μl、Naclease-Free Water 5.6 μl，共20 μl體系。反應條件：95℃預變性5 min，95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s擴增45個循環。每個反應重復3次，取3次結果的平均CT值作為最終結果。

1.4 統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行分析，數據以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 甲基化拷貝數計算用5個基因ALU-C4、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的每對引物純化后的RT-PCR產物制作標準曲線，做出每對引物的標準曲線［9］，通過標準曲線定出每個基因的實際甲基化的拷貝數。見圖2。

表2 qMSP內參及甲基化標志物

2.2 相對甲基化水平計算將實際甲基化的拷貝數代入以下公式，計算出相對甲基化水平值。相對甲基化水平值＝［（gene／ALU）sample／（gene／ALU）Standard］×1 000。

2.3 3 組間相對甲基化水平差異比較PCDH17基因：正常組（46.88±72.17）、膀胱癌組（382.67± 440.00）、尿路感染組（286.93±489.52），3組間差異有統計學意義（F＝7.267，P＜0.01）。POU4F2基因：正常組（0.35±0.50）、膀胱癌組（104.55± 94.74）、尿路感染組（9.63±28.87），3組間差異有統計學意義（F＝22.321，P＜0.01）。TCF21基因：正常組（24.82±36.95）、膀胱癌組（169.85± 169.52）、尿路感染組（78.71±41.79），3組間差異有統計學意義（F＝11.997，P＜0.01）。ZNF154基因：正常組（43.68±89.86）、膀胱癌組（480.96± 425.70）、尿路感染組（110.52±89.65），3組間差異有統計學意義（F＝18.420，P＜0.01）。

2.4 檢出限判定根據30個正常樣本中各基因的最大相對甲基化水平值確定各基因的檢出限，PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的檢出限分別為300.17、1.95、154.56、427.99。見圖3。

2.5 結果判定相對甲基化水平值高于檢出限判定為陽性，等于或低于檢出限判定為陰性。見表1。多種標志物聯用時，其中任一標志物陽性即判定為陽性結果。敏感性＝檢測結果為陽性的膀胱癌樣本數／總的膀胱癌樣本數，特異性＝檢測結果為陽性的非膀胱癌樣本數／總的非膀胱癌樣本數。見表3。

表3 甲基化標志物的敏感性和特異性

3 討論

膀胱癌分為尿路上皮癌、鱗狀細胞癌、腺細胞癌、小細胞癌、混合型癌、癌肉瘤以及轉移性癌等，其中以尿路上皮癌最常見，占90%以上。膀胱獨特的生理環境使得膀胱癌無創診斷成為可能，膀胱上皮細胞脫落至尿液中，可隨尿液排出體外，便于診斷。目前經美國食品和藥物管理局批準用于臨床的膀胱癌相關的無創診斷方法有尿細胞學、膀胱腫瘤抗原、核基質蛋白22、ImmunoCyt、熒光原位雜交，但其均存在一定的缺點，并不適合大規模高危人群篩查。

DNA甲基化狀態易于DNA序列發生改變，其對環境變化的敏感性更高，在細胞發生癌變的早期即可發現甲基化狀態的變化。因此，利用甲基化標志物診斷膀胱癌更適合高危人群篩查，且有利于發現癌前病變［5］。國外已有文獻［5－8，10］報道了膀胱癌特異的甲基化標志物，并利用MSP及qMSP技術在尿液中鑒別膀胱癌患者與正常個體，取得了較好的效果。但是這些研究主要集中在歐美國家，不同人種間的DNA甲基化狀態差異較大，這些甲基化標志物是否適用于中國人尚不清楚。

本研究選取了PCDH17、TCF21、VIM、POU4F2、ZNF154、TMEFF2、TWIST1、NID2共8個基因進行篩選，經過PCR產物電泳鑒定后選取PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154作為甲基化標志物進行后續實驗。PCDH17是原鈣黏蛋白家族的成員之一。PCDH17基因位于13q21.1，主要編碼鈣黏蛋白相關的神經受體，在特異的細胞與細胞之間的連接與功能中起作用［11］。有研究［12］報道PCDH17主要通過增加細胞間的黏附、信號轉導及生長控制而起到一定的抑癌作用。POU4F2是POU家族蛋白的一員，POU家族蛋白是包含有POU結構域的一類轉錄調控因子。POU4F2維持視神經元功能，研究［13］顯示POU4F2在乳腺癌中表達升高，起到促進腫瘤生長的功能。TCF21基因位于人類6號染色體6q23-24區域，研究［14］報道TCF21基因能夠促使間質細胞轉化為上皮細胞，這個過程的逆轉就是上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），TCF21基因的低表達會導致EMT，與多種腫瘤的侵犯和轉移有關。ZNF154與細胞的生長分化功能有關。ZNF154基因的高甲基化與非浸潤性膀胱癌的復發有關［10］。

通過在28例膀胱尿路上皮癌患者、10例尿路結石伴感染患者、30例健康志愿者尿液樣品中進行qMSP檢測，確定了4個標志物的檢出限分別為PCDH17 300.17、POU4F2 1.95、TCF21 154.56、ZNF154 427.99。最終發現以POU4F2單一甲基化標志物可達到最好的效果，敏感性92.86%，特異性97.50%。

利用qMSP技術診斷膀胱癌具有極高的敏感性，對早期膀胱癌檢出率高。本研究在實驗過程中共收集膀胱癌患者尿液75例，但提取出DNA符合qMSP實驗要求的只有28例，與Reinert et al［10］尿液DNA的提取成功率（約30%）相當。這可能是膀胱癌尿液甲基化診斷方式已誕生多年，但仍未推廣應用于臨床的技術難題之一。尿液采集前受檢者的飲水、活動狀態、尿液離體后的處理方式及時間、保存方式及提取方式等都有可能對提取成功率產生影響。要將尿液甲基化診斷膀胱癌推廣于臨床應用，必須要改變現有的尿液DNA保存及提取方式，達到提取成功率90%以上，而后進行大樣本、多中心研究及實驗證實。

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Diagnosis of bladder cancer based on urinary levels of POU4F2 hypermethylation

Wang Yongqiang1，2，Yu Yuan3，An Dan3，et al
（1Anhui Medical University，Hefei 230032；2Shenzhen Second People’s Hospital，Shenzhen 518035；3Beijing Genomics Institute at Shenzhen，Shenzhen 518083）

ObjectiveTo identify a panel of novel epigenetic biomarkers with high sensitivity and specificity that can be utilized in detection and diagnosis of bladder cancer using urine sediments.MethodsT24 cell lines that had been treated with bisulfite were used to examine the 8 methylated candidates that were previously reported in bladder cancer patients.Methylation levels of the candidate genes were quantified using the urine sediments from 28 bladder cancer patients，30 healthy volunteers and 10 infected urinary calculi patients by quantitative methylationspecific polymerase chain reaction（qMSP）.The four most efficacious and reliable biomarkers were selected after the sensitivity and specificity of each biomarker were further calculated and inspected.ResultsThe sensitivities of PCDH17，POU4F2，TCF21 and ZNF154 in the detection of bladder cancer were 46.43%，92.86%，39.29%and 46.43%respectively；the specificities of these biomarkers were 95.00%，97.50%，97.50%and 100.00%respectively.POU4F2 appeared as the best biomarkers among the four，showing a sensitivity of 92.86%and a specificity of 97.50%.ConclusionBladder cancer can be detected by a biomarker panel by using qMSP depending on the urine samples from patients.

bladder cancer；qMSP；hypermethylation；diagnosis

R 737.14；R 394.3；R 446.12

1000－1492（2015）02－0144－06

2014－10－13接收

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃項目）（編號：2014CB745200）

1安徽醫科大學，合肥 2300322深圳市第二人民醫院，深圳 5180353深圳華大基因研究院，深圳 5180834南方醫科大學珠江醫院，廣州 510280

王永強，男，碩士研究生；吳 松，男，研究員，責任作者，E-mail：doctor＿wusong＠126.com；蔡志明，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：caizhiming2000＠163.com