內質網應激標志性蛋白Caspase-12在四氯化碳誘導大鼠肝纖維化逆轉恢復模型中的作用研究

黃 艷，李曉慧，吳正升，王 歡，汪應紅，李海迪，孫仕偉，李 俊

內質網應激標志性蛋白Caspase-12在四氯化碳誘導大鼠肝纖維化逆轉恢復模型中的作用研究

黃 艷1，2，李曉慧1，2，吳正升3，王 歡1，2，汪應紅1，2，李海迪1，孫仕偉1，李 俊1，2

目的探討內質網應激（ERS）標志性蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶12（Caspase-12）在大鼠肝纖維化形成與逆轉恢復病程中的作用。方法建立四氯化碳（CCl4）誘導大鼠肝纖維化模型，蘇木精－伊紅染色和Masson膠原纖維染色觀察肝臟病理組織學改變；免疫組化法檢測肝組織肝纖維化標志性蛋白α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）以及鈣激活蛋白酶（Calpain）的表達；Western blot檢測不同時期肝臟組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達變化。結果肝臟病理組織學檢測提示肝纖維化逆轉恢復模型成功。免疫組化結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織中α-SMA和Calpain抗原陽性細胞明顯增多、著色明顯加深，且多分布在肝實質肝細胞區域。逆轉恢復期，α-SMA抗原表達陽性細胞與模型組比較逐漸下降。Calpain抗原表達陽性細胞主要分布在肝臟的小葉中央靜脈、匯管區、肝竇間隙等部位。Western blot結果顯示，模型組肝臟Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白的表達與正常組相比顯著升高。與模型組相比，逆轉恢復2、4和8周組肝組織Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白的表達降低，但仍高于正常組。結論 ERS標志性蛋白Caspase-12誘導的細胞凋亡存在于大鼠肝纖維化病程中，可能與肝纖維化的發生、發展和恢復逆轉密切相關。

肝纖維化；內質網應激；凋亡；Calpain；Caspase-12

內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是繼死亡受體活化和線粒體損傷之后第3條介導細胞凋亡的信號轉導通路。ERS誘導的3條主要凋亡通路為CHOP／GADD153基因的激活通路、氨基末端蛋白激酶（c-jun NH2-terminal protein kinasec-jun，JNK）激活通路和內質網特有的Caspase-12激活通路。目前研究［1－2］表明多種肝臟疾病的發生與Caspase-12介導的細胞凋亡有關。但Caspase-12介導的細胞凋亡是否存在于肝纖維化的進展、逆轉恢復期中，其作用如何尚未有文獻報道。該實驗建立在四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導的大鼠肝纖維化逆轉恢復模型基礎上，觀察ERS標志性蛋白Caspase-12在CCl4誘導肝纖維化、逆轉恢復期中的變化及其可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只雄性SD大鼠，SPF級，180～220 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑CCl4購自汕頭西隴化工廠；細胞組織裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF購自上海碧云天公司；毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）、衣霉素（tunicamycin，TN）、丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺購自美國Sigma公司；Cleaved-Caspase-3抗體購自美國Cell signaling公司；Cleaved-Caspase-12抗體購自美國Biovision公司；Calpain和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根酶（horseradish peroxidase，HRP）標記抗兔和抗鼠免疫球蛋白（immunoglobin G，IgG）購自北京中杉金橋公司；ECL化學發光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型建立 大鼠隨機分為正常組、模型組、逆轉恢復2周組、逆轉恢復4周組和逆轉恢復8周組，每組10只。除正常組外，每組大鼠按1 ml／kg皮下注射CCl4溶液（按體積比CCl4：花生油＝1∶1），一周2次，共12周。正常組以相同方法注射等量花生油作對照。模型組、逆轉恢復2周組、逆轉恢復4周組、逆轉恢復8周組分別于造模結束后第0、2、4、8周分批處死大鼠，取肝組織樣本迅速冷凍保存。

1.3.2病理學檢查 肝組織用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，做常規組織切片，蘇木精－伊紅（HE）染色和Masson膠原纖維染色，鏡下觀察并比較不同時期組織的病理變化。

1.3.3免疫組化檢測肝組織α-SMA和Calpain蛋白表達 大鼠肝組織用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片。采用SP法染色，切片常規脫蠟，加50 μl過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育15 min；PBS沖洗后加0.1%的胰蛋白酶消化20 min，加50 μl非免疫性動物血清，室溫下孵育10 min；加50 μl的一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗后加50 μl生物素標記的二抗，室溫下孵育30 min；再加50 μl鏈霉菌抗生素蛋白－過氧化物酶溶液，室溫下孵育30 min；DBA顯色、蘇木精復染、封片觀察。

1.3.4Western blot法檢測肝組織Calpain、Cleaved-Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表達 取經處理后的肝組織，加500 μl RIPA細胞裂解液、5 μl PMSF于冰上裂解30 min后4℃、12 000 r／min離心30 min。取上清液，用BCA法進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移法將蛋白轉移至PVDF濾膜上。用5%的脫脂牛奶封閉3 h后，與1∶500一抗4℃孵育過夜。再與1∶5 000的HRP標記的IgG室溫孵育1 h，ECL顯色，Quantity One軟件測定分析結果。采用β-actin作為內參照，分別以相應蛋白與β-actin光密度比值表示該蛋白相對表達水平。1.4 統計學處理使用SPSS 13.0軟件進行分析，數據以±s表示，采用方差分析檢驗。

2 結果

2.1 肝組織病理變化HE染色及Masson膠原纖維染色結果顯示正常組大鼠肝臟組織結構完整、清晰，肝小葉結構正常，肝細胞排列成肝索狀；模型組可見大量膠原纖維沉積于小葉中央靜脈、匯管區、肝竇間隙等部位形成纖維間隔及假小葉，并伴有大量脂肪空泡。停止注射CCl4，經2、4、8周，可見大鼠肝臟組織結構中脂肪空泡逐漸減少，纖維間隔逐漸變窄，纖維沉積程度逐漸減輕，提示CCl4誘導大鼠肝纖維化以及逆轉恢復模型成功。見圖1。

2.2 肝纖維化不同時期肝組織中α-SMA和Calpain蛋白表達 免疫組化法檢測α-SMA和Calpain蛋白在肝纖維化大鼠不同時期肝組織中的表達，陽性染色細胞質呈棕黃色顆粒。結果顯示正常組大鼠肝臟組織中α-SMA和Calpain抗原陽性表達較少，模型組大鼠肝臟組織中α-SMA和Calpain抗原陽性細胞明顯增多、著色明顯加深，且多分布在肝實質區域。逆轉恢復2、4、8周組中，α-SMA、Calpain抗原表達陽性細胞與模型組比較，隨著逆轉恢復期時間延長，陽性表達細胞數量及程度逐漸下降，Calpain抗原表達陽性細胞主要分布在肝臟的小葉中央靜脈、匯管區、肝竇間隙等部位，與肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）大致位置相同。提示肝纖維化逆轉恢復期表達α-SMA的活化的HSCs逐漸減少，肝細胞凋亡減少。見圖2。

2.3 Western blot法檢測不同時期肝組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達與正常組大鼠肝臟組織相比，模型組大鼠肝臟組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達明顯增多；而與模型組相比，肝纖維化逆轉恢復2、4、8周組中，Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖3。

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病發展的共同病理基礎，其發病機制與肝細胞大量凋亡和靜止的HSCs活化增殖，合成大量膠原為主的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積引起［3］。因此，抑制肝細胞壞死凋亡和促進活化的HSCs凋亡，有助于肝纖維化的逆轉恢復［4］。

研究［5－7］表明ERS在肝纖維化的進展期抑制HSCs活化，在肝纖維化逆轉恢復期促進活化的HSCs凋亡。研究［8］顯示HSCs與ERS誘導劑TG或TN體外共培養，CHOP、JNK和Caspase-12的表達明顯變化，其可能與逆轉恢復期ERS誘導活化HSCs凋亡增加密切相關。

有研究［9－10］表明，當ERS激活時，內質網將儲存的Ca2＋釋放到細胞胞質中與鈣離子結合位點結合，從而激活Calpain。細胞質鈣活化蛋白導致的鈣外流的刺激，裂解并且激活Caspase-12，啟動下游的凋亡路徑Caspase-3，發生凋亡蛋白酶級聯反應［11－12］。本實驗建立CCl4誘導大鼠肝纖維化逆轉恢復模型，采用HE染色、Masson膠原纖維染色驗證模型成功。免疫組化法檢測α-SMA和Calpain蛋白在大鼠肝組織中的表達。結果表明，隨著恢復期時間延長，大鼠肝組織中α-SMA和Calpain陽性表達細胞數量及程度逐漸下降提示HSCs活化降低；而Calpain抗原表達陽性細胞主要分布在肝臟的小葉中央靜脈、匯管區、肝竇間隙等部位，與HSCs細胞的大致位置相同，提示Ca2＋依賴性Calpain活化可能參與Caspase-12誘導的大鼠HSCs凋亡。Western blot法結果進一步表明，模型組大鼠肝臟組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達較正常組明顯增多；而肝纖維化恢復期2、4、8周組中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達明顯降低，與模型組相比差異有統計學意義。結合實驗室前期研究結果：模型組Cleaved-Caspase-12表達顯著上升，提示Caspase-12誘導的肝細胞凋亡參與肝纖維進展期；在肝纖維化逆轉復期，Cleaved-Caspase-12在活化HSCs中表達增強，誘導活化HSCs凋亡增加，但其整體表達水平逐漸下降，提示其誘導的肝細胞凋亡顯著降低。本實驗結果表明，ERS存在于大鼠肝纖維化病程中，其可能參與肝細胞和HSCs增殖活化、凋亡的調控，與肝纖維化的發生、發展和逆轉恢復密切相關。

［1］ De Minicis S，Candelaresi C，Agostinelli L，et al.Endoplasmic Reticulum stress induces hepatic stellate cell apoptosis and contributes to fibrosis resolution［J］.Liver Int，2012，32（10）：1574－84.

［2］ Liu Y，Wang J，Qi S Y，et al.Reduced endoplasmic reticulum stress might alter the course of heart failure via caspase-12 and JNK pathways［J］.Can J Cardiol，2014，30（3）：368－75.

［3］ Lin J，Wu J F，Zhang Q，et al.Virus-related liver cirrhosis：molecular basis and therapeutic options［J］.World J Gastroenterol，2014，20（21）：6457－69.

［4］ Liu H，Li J，Huang Y，et al.Inhibition of transient receptor potential melastain 7 channel increases HSCs apoptosis induced by TRAIL［J］.Life Sci，2012，90（15－16）：612－8.

［5］ 李曉慧，李 俊，黃 艷，等.TRAIL通過內質網應激對肝星狀細胞凋亡的調控及部分機制的研究［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（7）：863－7.

［6］ 謝加力.ERS與TRAIL在大鼠肝星狀細胞凋亡中的相互關系探討［D］.合肥：安徽醫科大學，2012.

［7］ 謝加力，李 俊，黃 艷，等.大鼠肝纖維化進程中內質網應激相關蛋白的動態變化研究［J］.安徽醫科大學學報，2012，47（9）：1028－32.

［8］ Huang Y，Li X，Wang Y，et al.Endoplasmic reticulum stress-induced hepatic stellate cell apoptosis through calcium-mediated JNK／P38 MAPK and Calpain／Caspase-12 pathways［J］.Mol Cell Biochem，2014，394（1－2）：1－12.

［9］ Kim do Y，Chung S I，Ro S W，et al.Combined effects of an antioxidant and caspase inhibitor on the reversal of hepatic fibrosis in rats［J］.Apoptosis，2013，18（12）：1481－91.

［10］Zhu Y，Men R，Wen M，et al.Blockage of TRPM7 channel induces hepatic stellate cell death through endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis［J］.Life Sci，2014，94（1）：37－44.

［11］Mu Y，Liu P，Du G，et al.Action mechanism of Yi Guan Jian Decoction on CCl4induced cirrhosis in rats［J］.J Ethnopharmacol，2009，121（1）：35－42.

［12］Mazumdar B，Meyer K，Ray R.N-terminal region of gelsolin induces apoptosis of activated hepatic stellate cells by a caspase-dependent mechanism［J］.PLoS One，2012，7（8）：e44461.

Effect of endoplasmic reticulum stress protein caspase-12 in carbon tetrachloride-induced reversible liver fibrosis in rats

Huang Yan1，2，Li Xiaohui1，2，Wu Zhengsheng3，et al
（1School of Pharmacy，2Institute for Liver Diseases，3Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo detect the effect of endoplasmic reticulum stress（ERS）-related protein Caspase-12 in rat liver fibrosis and spontaneous reversal process.MethodsLiver fibrosis model was induced by CCl4in rats，the protein expressions of Calpain and α-SMA were detected by immunohistochemical staining.The protein expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 in liver tissue were measured by Western blot.ResultsImmunohistochemistryResultsshowed that compared with the normal group，α-SMA and calpain antigen-positive cells of rat liver tissue in model group were significantly increased，distributing in liver parenchymal area.Compared with model group，in recovery model，α-SMA antigen-positive cells decreased.Calpain antigen-positive cells were mainly distributed in the liver lobule central vein，portal area，sinusoidal gap and other parts.Western blotResultsshowed that compared with the control group，expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 were significantly enhanced in the model group.Compared with the model group，expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 were decreased in spontaneous recovery after 2，4 and 8 weeks.ConclusionERS-related protein Caspase-12 might be related to the progression and regrossion of liver fibrosis.

liver fibrosis；endoplasmic reticulum stress；apoptosis；Calpain；Caspase-12

R 575.2

1000－1492（2015）02－0140－04

2014－12－12接收

國家自然科學基金資助項目（編號：81102493、30873081）；國家教育部博士點新教師基金資助項目（編號：20103420120001）；安徽醫科大學國家級大學生創新創業訓練計劃項目（編號：201310366030）

安徽醫科大學1藥學院基礎與臨床藥理教研室、2肝病研究所，合肥 2300323安徽醫科大學第一附屬醫院病理科，合肥230022

黃 艷，女，博士，副教授，碩士生導師；李 俊，男，博士，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lijun＠ahmu.edu.cn