毛蕊花糖苷對高脂模型大鼠血脂及血管內皮細胞Bax-Bcl2表達的影響

鄧志軍，劉若軒，李常青，郭潔文，李麗明，齊耀群，李阿榮，王佳佳

(1.廣州市中醫醫院藥學部，廣東廣州510130；2.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州510405)

毛蕊花糖苷對高脂模型大鼠血脂及血管內皮細胞Bax-Bcl2表達的影響

鄧志軍1，劉若軒1，李常青2，郭潔文1，李麗明1，齊耀群1，李阿榮1，王佳佳1

(1.廣州市中醫醫院藥學部，廣東廣州510130；2.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州510405)

目的研究毛蕊花糖苷對高脂模型大鼠血管內皮細胞凋亡相關蛋白的表達作用。方法高脂飲食喂養建立高血脂模型，設模型組、辛伐他汀組(10 mg/kg)、毛蕊花糖苷低劑量組(50 mg/kg)、毛蕊花糖苷中劑量組(100 mg/kg)、毛蕊花糖苷高劑量組(200 mg/kg)和空白對照組，利用生化分析儀測定血脂、抗氧化指標，采用Western-blot法測定腹主動脈中細胞凋亡相關蛋白基因Bax與Bcl-2的表達。結果與模型組比較，毛蕊花糖苷高劑量組能顯著降低模型大鼠血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平與脂質過氧化產物(MDA)含量(P＜0.01)，總超氧化物歧化酶(T-SOD)含量與高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平明顯提高(P＜0.01或P＜0.05)。毛蕊花糖苷中、高劑量組Bax蛋白表達顯著下調、Bcl-2蛋白表達明顯上升(P＜0.01)。結論毛蕊花糖苷通過調節凋亡蛋白Bax-Bcl-2，對抗高脂模型大鼠所致的血管內皮細胞凋亡及高脂血癥所致的氧化損傷。

毛蕊花糖苷；熟地黃；細胞凋亡；Bax；Bcl-2

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

熟地黃高純度單體提取物，含毛蕊花糖苷大于98%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號20130053；辛伐他汀片，默沙東制藥有限公司，批號100548，用0.5%CMC-Na配成混懸劑；膽固醇，Sigma公司；丙二醇，廣州化學試劑廠；脫氧膽酸鈉，廣州浩瑪生物科技有限公司；蔗糖，廣州化學試劑廠；血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，上海科華生物工程股份有限公司；總超氧化物歧化酶(TSOD)、脂質過氧化產物(MDA)，南京建成生物工程研究所；小鼠抗大鼠Bcl-2單抗(克隆系C-2)、小鼠抗大鼠Bax單抗(克隆系B-9)，美國Santa cruz公司；二抗為HRP標記的兔抗羊，武漢博士的生物科技有限公司；內參選用β-actin DAB顯色，北京中杉生物技術公司。

1.2 高脂肪乳劑的制備

高純度豬油400 g，加熱至液化，加入膽固醇150 g、吐溫-20 40 g，液化成油相；蒸餾水300 mL，加入全脂奶粉100 g、蔗糖150 g、丙二醇32 g，加熱至60℃，加入脫氧膽酸鈉15 g，混合均勻，制成水相，然后倒入油相中混勻，冷卻后4℃儲藏，使用時50℃左右化開。

1.3 實驗儀器

KDC-220HR高速冷凍離心機，科大創新股份有限公司中佳分公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；202-0S臺式干燥箱，蘇州江東精密儀器有限公司；EL-160電子分析天平，日本島津公司；ECHO全自動生化分析儀，意大利樂高特儀器公司；Lecia切片機，德國LECIA公司；HSWX-420BS電熱恒溫水(浴)箱，上海圣科儀器設備有限公司；BIO-RAD GC-800光密度掃描儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；ZFMQ050PE超純水器，美國Millipore公司。

1.4 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠80只，體質量180～200 g，廣東省醫學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK(粵)2013-0002。

1.5 高血脂模型的建立及分組給藥

80只SD雄性大鼠適應飼養1周后，按體質量隨機分為空白對照組10只，高血脂模型組70只，模型組灌飼高脂肪乳劑1 mL/100 g，每日2次，空白對照組給予等容積溶媒。連續喂養5周后，末次給藥后次日，眶后靜脈叢取血，測定TC，以TC在5～10 mmol/L范圍內判定造模成功。從造模成功的大鼠中隨機抽取50只，分為模型組、辛伐他汀組，毛蕊花糖苷低劑量組(50 mg/kg)、毛蕊花糖苷中劑量組(100 mg/kg)、毛蕊花糖苷高劑量組(200 mg/kg)，各給藥組大鼠均連續給藥4周，空白對照組及模型組給予等容積溶媒。

1.6 血漿樣品的采集、處理

各組大鼠均腹腔注射10%(φ)的水合氯醛麻醉，腹主動脈取血；在4 000 r/min，離心10 min，取離心的上清血清按試劑盒說明書操作，生化分析儀測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA及T-SOD含量，MDA和硫代巴比妥酸在95℃的條件下可以生成棕紅色的3，5，5-三甲基惡唑-2，4二酮，其在532 nm處有最大吸收；T-SOD黃嘌呤氧化酶經反應產生的硝酸鹽減少，在550 nm的波長上檢測。

1.7 Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達水平

將剝取的主動脈約100 mg用冷PBS洗2次，放入研缽中，加入預冷細胞裂解液RIPA裂解細胞，研磨后吸出于1.5 mL EP管內，再加入500 μL RIPA，研磨后吸出于上EP管內，在冰面上裂解30 min，4℃、14 000 r/min離心10 min后，將上清分裝于0.5 mL EP管內，每管100 μL，－20℃保存待用，用BCA法蛋白定量；常規蛋白電泳分離膠濃度為10% (pH8.8)，濃縮膠濃度5%(pH 6.8)，將純化的蛋白行SDS-PAGE電轉至PVDF膜；5%脫脂奶粉4℃封閉30 min，一抗孵育過夜小鼠抗大鼠Bax(1∶100)、Bcl-2(1∶150)、β-actin(1∶100)，TBST洗滌3次后，加入HRP標記的山羊抗大鼠的二抗室溫搖床孵育45 min，TBST常規洗膜3次后，ECL化學發光試劑顯色；用BIO-RAD GC-800光密度掃描儀對膠片進行掃描并保存，β-actin為內參對照，計算相對含量。BIO-RAD分析軟件對蛋白含量進行灰度值分析，以各實驗組中目的蛋白Bcl-2、Bax與相應的內參βactin的灰度的比值作為計算目的蛋白的相對含量。1.8 統計學分析

2 結果

2.1 毛蕊花糖苷對模型大鼠血脂的影響

如表1所示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C顯著升高，HDL-C顯著降低(P＜0.01)，提示造模成功。與模型組比較，毛蕊花糖苷高劑量組可顯著降低模型大鼠血清TC、TG、LDL-C水平(P＜0.01)，提高HDL-C水平(P＜0.05)，毛蕊花糖苷中、低劑量組改善血脂的效果依次降低。

表1 毛蕊花糖苷對模型大鼠血脂的影響Table 1 Effects of verbascoside on the level of blood lipid in model rats(±s，n＝10)

表1 毛蕊花糖苷對模型大鼠血脂的影響Table 1 Effects of verbascoside on the level of blood lipid in model rats(±s，n＝10)

與空白對照組比較:＃＃P＜0.01；與模型組比較:?P＜0.05，??P＜0.01。

組別 劑量/ (mg·kg－1) c(TC)/ (mmol·L－1) c(TG)/ (mmol·L－1) c(HDL-C)/ (mmol·L－1) c(LDL-C)/ (mmol·L－1)空白對照組 － 2.56±0.57 1.85±0.43 2.28±0.39 1.97±0.39模型組 － 10.16±2.15＃＃9.84±2.27＃＃1.08±0.21＃＃2.99±0.31＃＃辛伐他汀組 10 6.12±1.27??7.43±1.57?2.03±0.47?2.03±0.41?毛蕊花糖苷低劑量組 50 8.99±1.78?8.98±2.14 1.41±0.33 2.68±0.33中劑量組 100 7.87±0.45?8.04±1.21 1.76±0.46?2.44±0.54?高劑量組 200 6.50±2.33??7.48±1.32?1.96±0.31??2.11±0.33?

2.2 毛蕊花糖苷對模型大鼠血清T-SOD、MDA的影響

如表2所示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清T-SOD顯著降低(P＜0.01)、MDA升高(P＜0.05)，提示高血脂會影響抗氧化能力。與模型組比較，毛蕊花糖苷各劑量組均能不同程度改善抗氧化指標，其中毛蕊花糖苷高劑量組可顯著升高T-SOD、降低MDA含量(P＜0.01)，抗氧化作用最強。

2.3 毛蕊花糖苷對模型大鼠主動脈Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠的Bax蛋白表達顯著上調、Bcl-2蛋白表達顯著下調(P＜0.01)。與模型組比較，毛蕊花糖苷提取物中、高劑量組的Bax蛋白表達均能顯著下調、Bcl-2蛋白表達也能顯著上調、Bcl-2/Bax比值顯著升高(P＜0.01)。見圖1、表3。

表2 毛蕊花糖苷對模型大鼠血清T-SOD、MDA的影響Table 2 Effects of verbascoside on serum T-SOD and MDA levels in model rats(±s，n＝10)

表2 毛蕊花糖苷對模型大鼠血清T-SOD、MDA的影響Table 2 Effects of verbascoside on serum T-SOD and MDA levels in model rats(±s，n＝10)

與空白對照組比較:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較: ?P＜0.05，??P＜0.01。

組別 劑量/ (mg·kg－1) T-SOD/ (U·mg－1) MDA/ (nmol·mg－1)空白對照組 － 329.33±35.78 9.64±1.97模型組 － 232.17±36.28＃＃13.72±3.64＃辛伐他汀組 10 286.65±33.79?11.32±2.48?毛蕊花糖苷低劑量組 50 237.25±44.78 12.75±2.59中劑量組 100 262.91±50.39?11.37±2.79高劑量組 200 308.16±52.47??9.44±2.09??

圖1 Western blot檢測各組Bax、Bcl-2的蛋白表達Figure 1 Expression of Bax and Bcl-2 protein detected by western blot

表3 毛蕊花糖苷對模型大鼠主動脈Bax、Bcl-2蛋白表達影響Table 3 Effects of verbascoside on Bax and Bcl-2 expression in abdominal aorta in model rats(±s，n＝10)

表3 毛蕊花糖苷對模型大鼠主動脈Bax、Bcl-2蛋白表達影響Table 3 Effects of verbascoside on Bax and Bcl-2 expression in abdominal aorta in model rats(±s，n＝10)

與空白對照組比較:＃＃P＜0.01；與模型組比較:?P＜0.05，??P＜0.01。

組別 劑量/ (mg·kg－1) Bax Bcl-2 Bcl-2/Bax空白對照組 － 0.22±0.03 0.99±0.24 4.31±0.71模型組 － 1.05±0.31＃＃0.25±0.03＃＃0.22±0.04＃＃辛伐他汀組 10 0.49±0.14??0.46±0.14?0.97±0.36?毛蕊花糖苷低劑量組 50 0.89±0.26 0.37±0.13?0.45±0.09?中劑量組 100 0.65±0.15??0.63±0.20??0.93±0.31??高劑量組 200 0.38±0.09??0.80±0.23??2.35±0.53??

3 討論

毛蕊花糖苷是熟地黃中的主要有效成分，研究已證實其具有神經保護、降血糖、抗衰老、免疫調節等作用[2]。本研究通過建立高脂血癥模型大鼠，研究毛蕊花糖苷對血管內皮細胞凋亡相關蛋白表達作用。

高脂血癥通過激活血管平滑肌細胞 Wnt/βcatenin信號通路，平滑肌細胞增殖增加、表型改變，損傷內皮細胞，促進細胞呼吸鏈上活性氧產生，激活細胞內氧化應激損傷，破壞細胞膜的骨架和細胞質結構與功能，誘導內皮細胞凋亡或壞死[3-4]。高脂血癥使血管內皮細胞自由基釋放增加，直接損傷動脈壁的抗氧化功能[5-6]。因此提高機體抗氧化防御能力、有效清除自由基，可抵抗脂質過氧化物生成，并抵御自由基和脂質過氧化物損傷機體。

Bax與Bcl-2兩種基因是調控細胞凋亡的關鍵因素，Bax同源二聚體的形成調控著細胞對凋亡的易感性，Bax處于優勢則細胞死亡，Bcl-2作用相反，兩者的比值決定著細胞凋亡抑制作用的強弱；抗凋亡機制又與抗氧化作用密切相關[7]。本研究結果顯示高脂血癥大鼠的主動脈Bax蛋白表達顯著增高，Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax比值顯著減低，證實高脂血癥可誘導血管內皮細胞凋亡；給予毛蕊花糖苷后其Bax蛋白表達增高、Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax比值減低，提示毛蕊花糖苷與Bcl-2基因具有協同效應，共同對抗高脂血癥所致的氧化損傷，這也與既往發現熟地黃可抑制脂質過氧化產物MDA含量、具有抗氧化作用的文獻報道一致[8]。

本實驗利用生化分析儀測定血脂、抗氧化指標，并采用Western blot法測定毛蕊花糖苷對高脂模型大鼠腹主動脈中細胞凋亡相關蛋白基因Bax與Bcl-2表達，為闡明脈復生的藥效物質基礎及作用機制提供了理論與實驗依據，但Bcl-2蛋白表達是通過哪種基因通路調節血脂尚需進一步研究。

[1]鄧敏，鞠曉東，樊東升，等.毛蕊花苷對 MPP＋誘導的SHSY5Y細胞凋亡的保護作用[J].中國藥理學通報，2008，24(10):1297-1302.

[2]楊云，張華鋒，劉炯，等.道地產區不同品種懷地黃中梓醇及毛蕊花糖苷的含量比較[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19(16):97-101.

[3]RODRIGUEZ C，SLEVIN M，RODRIGUEZ-CALVO R，et al. Modulation of endothelium and endothelial progenitor cell function by low-density lipoproteins: implication for vascular repair，angiogenesisand vasculogenesis[J]. Pathobiology，2009，76(1):11-22.

[4]莊瑜，肖明第，呂志前，等.Wnt/beta-catenin信號通路在高脂血癥中的激活[J].現代生物醫學進展，2012，12 (9):1624-1627.

[5]霍陽，初巍巍，宋濤，等.維生素E對高脂血癥小鼠血管內皮細胞凋亡相關蛋白基因表達的影響[J].解放軍醫藥雜志，2013，25(12):62-65.

[6]段宗強.木犀草素對高脂血癥大鼠血脂、血糖及氧化應激指標的影響[J].中醫學報，2014，29(1):55-57.

[7]KAUNTZ H，BOUSSEROUEL S，GOSSE F，et al.Silibinin，a naturalflavonoid，modulates the early expression of chemoprevention biomarkers in a preclinical model of colon carcinogenesis[J].Int J Oncol，2012，41(3):849-854.

[8]麻銳，丁瑞恒，廖蘊華.不同濃度地黃對大鼠腎組織抗氧化作用的研究[J].內科，2012，7(3):220-223.

(責任編輯:幸建華)

Effects of verbascoside on the expression of lipid and Bax-Bcl2 in vascular endothelial cells in rats with hyperlipidemia

DENG Zhijun1，LIU Ruoxuan1，LI Changqing2，GUO Jiewen1，LI Liming1，QI Yaoqun1，LI Arong1，WANG Jiajia1
(1.Department of Pharmacy，Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China；2.Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

ObjectiveTo study the effects of verbascoside on the expression of apoptosis-related proteins in vascular endothelial cells in rats with hyperlipidemia.MethodsThe rat models with hyperlipidemia were established by feeding high-lipid diets and then were randomly divided into the model group，the simvastatin group(10 mg/kg)，three verbascoside groups with low，middle and high dosages(50，100 and 200 mg/ kg)，and the control group.The blood lipids and antioxidant index were determined by biochemical analyzer.The expression of apoptosis-related protein Bax and Bcl-2 in abdominal aorta was determined by western blot.ResultsCompared to the model group，the high dosage verbascoside group significantly reduced the levels of serum total cholesterol(TC)，glycerol lipid(TG)，low density lipoprotein cholesterol (LDL-C)and lipin peroxide(MDA)(P＜0.01)，and increased the levels of total superoxide dismutase(T-SOD)and high density lipoprotein cholesterol(HDL-C)(P＜0.05 or P＜0.01).The expression of Bax in middle and high dosage groups was significantly decreased，but Bcl-2 expression was increased(P＜0.01).ConclusionVerbascoside can reduce the apoptosis of vascular endothelial cells and oxidative damage in rats with hyperlipidemia through regulation of Bax and Bcl-2 expression.

verbascoside；Radix Rehmanniae；apoptosis；Bax；Bcl-2“脈復生”是我院研制并用于治療血栓閉塞性脈管炎的特色中藥制劑，熟地黃是君藥，由玄參科植物地黃加工炮制而成。現代藥理研究[1]證實其活性成分毛蕊花糖苷可通過線粒體膜電位的高能狀態抑制caspase-3活性對抗MPP＋誘導的SHSY5Y細胞凋亡。本實驗研究了毛蕊花糖苷對高脂模型大鼠血管內皮細胞凋亡的保護作用，為闡明脈復生的藥效物質基礎及作用機制提供理論與實驗依據。

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.015

1006-8783(2015)05-0625-04

2015-06-07

廣東省中醫藥局基金項目(20141227，20151065)；廣州市中醫藥和中西醫結合科技項目(20152A011011，

20142A011012)

鄧志軍(1980—)，男，碩士，主管藥師，主要從事抗代謝綜合征的天然藥物開發，Email:86878226＠qq.com；通信作者:郭潔文(1968—)，女，主任藥師，博士生導師，主要從事天然藥物開發，Email:guo774＠sina.com。

時間:2015-09-24 16:11

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150924.1611.008.html