廣藿香內(nèi)生真菌Bipolaris sorokiniana的次級代謝產(chǎn)物及其抗腫瘤活性研究

王沫，陳玉嬋，李浩華，孫章華，譚國慧，嚴寒靜，章衛(wèi)民，郭曉玲

(1.廣東藥學院中心實驗室，廣東廣州510006；2.廣東省微生物研究所/省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東廣州510070)

天然藥物化學

廣藿香內(nèi)生真菌Bipolaris sorokiniana的次級代謝產(chǎn)物及其抗腫瘤活性研究

王沫1，2，陳玉嬋2，李浩華2，孫章華2，譚國慧2，嚴寒靜1，章衛(wèi)民2，郭曉玲1

(1.廣東藥學院中心實驗室，廣東廣州510006；2.廣東省微生物研究所/省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東廣州510070)

目的研究分離自廣藿香中的內(nèi)生真菌索氏平臍蠕孢(Bipolaris sorokiniana，A606)的活性次級代謝產(chǎn)物，并初步考察其抗腫瘤活性。方法采用正相硅膠柱層析、C18反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析、高效液相色譜法以及薄層層析等色譜技術(shù)對菌株A606發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物進行分離純化，并通過各種波譜分析進行結(jié)構(gòu)鑒定；采用SRB染色法對化合物進行細胞毒活性研究。結(jié)果從發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離鑒定出8個化合物，分別為麥角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮(1)、2-[4-(2-aminoethoxy)phenyl]ethanol(2)、鄰苯二甲酸-二(2-乙基-己基)酯(3)、5-羥甲基糠醛(4)、3，5-二羥基甲苯(5)、對羥基苯乙醇(6)、5-甲基-2-呋喃甲醇(7)、3，4，6-trimethylcyclohex-3-en-1-ol(8)；化合物1對4種腫瘤細胞株SF-268、MCF-7、NCI-H460和HepG-2的IC50值分別為20.84、15.31、13.62、25.45 μmol/L。結(jié)論化合物1～4、7～8均為首次從該屬真菌中分離得到，其中化合物1對4種腫瘤細胞具有顯著的抑制作用。

索氏平臍蠕孢；內(nèi)生真菌；廣藿香；細胞毒活性

植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物組織內(nèi)，但不對植物組織引起明顯病害癥狀的真菌[1]。內(nèi)生真菌物種豐富多樣，它們處于植物內(nèi)部的特殊環(huán)境中，能夠產(chǎn)生各種結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物，容易從中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎并具有多種生物活性的化合物[2]。因此，內(nèi)生真菌已成為發(fā)現(xiàn)新天然活性物質(zhì)的重要資源，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力。

廣藿香[Pogostemon cablin(Blanco)Benth.]為唇形科草本藥用植物，本課題組前期對廣藿香內(nèi)生真菌索氏平臍蠕孢(Bipolaris sorokiniana，A606)發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物進行了抗腫瘤活性篩選，發(fā)現(xiàn)其對肝癌細胞(HepG-2)、神經(jīng)癌細胞(SF-268)、乳腺癌細胞(MCF-7)和肺癌細胞(NCI-H460)有明顯的抑制作用(100 μg/mL的濃度下，對4種腫瘤細胞的抑制率全部超過80%)。為了進一步發(fā)掘該菌株A606的活性次級代謝產(chǎn)物，本文對該菌株進行了大量液體發(fā)酵培養(yǎng)，對獲得的菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物進行分離純化，從中分離得到8個單體化合物，分別鑒定為麥角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮(1)、2-[4-(2-aminoethoxy)phenyl]ethanol(2)、鄰苯二甲酸-二(2-乙基-己基)酯(3)、5-羥甲基糠醛(4)、3，5-二羥基甲苯(5)、對羥基苯乙醇(6)、5-甲基-2-呋喃甲醇(7)、3，4，6-trimethylcyclohex-3-en-1-ol(8)，并對以上化合物進行了細胞毒活性測試。

1 材料、試劑與儀器

1.1 生物材料及菌株鑒定

肝癌細胞(HepG-2)、神經(jīng)癌細胞(SF-268)、乳腺癌細胞(MCF-7)和肺癌細胞(NCI-H460)均由江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室蔣繼宏教授提供。索氏平臍蠕孢A606從廣東省高要市采集的廣藿香中分離獲得，廣藿香由廣東藥學院中藥學院嚴寒靜副教授鑒定為 Pogostemon cablin(Blanco) Benth.。將分離得到的菌株經(jīng)總DNA制備，采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，正向)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向)擴增分離菌株rDNA ITS區(qū)，測序獲得的序列(GenBank登錄號為 KF494823)通過BLAST程序在GenBank上進行相似性序列檢索分析，結(jié)果與 Bipolaris sorokiniana B41(GenBank登錄號為KF725816)的相似度為99.6%，因此鑒定菌株A606為索氏平臍蠕孢Bipolaris sorokiniana。菌種保存于廣東省微生物研究所。

1.2 試劑

柱色譜硅膠(100～200目，200～300目，青島海洋化工廠)；GF254高效薄層硅膠板(Merck公司)；C18反相硅膠(40～75 μm，F(xiàn)uji Silysia Chemical Ltd.)；凝膠Sephadex LH-20(18～110 μm，Amersham Biosciences Ltd.)；其余試劑均為分析純，購自廣州化學試劑廠。1.3 儀器

AVANCE III型 500 MHz核磁共振波譜儀(Bruker公司)；API 2000 LC/MS/MS質(zhì)譜儀(MDS Sciex公司)；LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；ZF-6型三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；Hangping FA2004電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；PZ1000B旋轉(zhuǎn)式大容量普通搖床(武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司)；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；超凈工作臺(上海恒益科技有限公司)。

2 方法

2.1 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基:馬鈴薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，維生素B1 0.01 g/L，pH自然。在無菌條件下，用接種鏟挑取適量菌體接種到裝有250 mL培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，在28℃、120 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d，獲得種子液，然后取適量種子液轉(zhuǎn)接到裝有250 mL培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，培養(yǎng)條件與種子液相同，培養(yǎng)7 d，共接種120 L。

2.2 提取與分離

取發(fā)酵產(chǎn)物120 L用4層紗布濾過，得發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取5次(發(fā)酵液-乙酸乙酯體積比為1∶1)，40℃下減壓濃縮，得到發(fā)酵液粗提物18.8 g。發(fā)酵液粗提物經(jīng)硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯體積比50∶1～1∶2和二氯甲烷-甲醇體積比為5∶1)梯度洗脫，用薄層色譜檢測(顯色劑為茴香醛-濃硫酸試劑)，合并相似組分，得到32個組分(Fr.1～Fr.32)。Fr.13經(jīng)Sephadex LH-20以二氯甲烷-甲醇(體積比1∶1)洗脫得到亞組分Fr.13-3和Fr.13-4，將Fr.13-3經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯體積比30∶1)和PTLC制備得化合物3(8.6 mg)，將Fr. 13-4過反相硅膠柱層析(甲醇-水體積比30∶70)得到化合物1(4.6 mg)。將Fr.30-5-7過反相硅膠柱層析(甲醇-水體積比30∶70～60∶40)得到化合物8(2.1 mg)，將Fr.30-6過反相硅膠柱層析(甲醇-水體積比30∶70)得到化合物2(3.0 mg)。Fr.18經(jīng)Sephadex LH-20以二氯甲烷-甲醇(體積比1∶1)洗脫、反相硅膠柱層析(甲醇-水體積比20∶80)得化合物4(5.6 mg)。Fr.20經(jīng)Sephadex LH-20以二氯甲烷-甲醇(體積比1∶1)洗脫得Fr.20-6～Fr.20-6。將Fr.20-5經(jīng)反相硅膠柱層析(甲醇-水體積比20∶80～50∶50)得到Fr.20-5-2，通過制備YMC-Pack SIL正相柱(正己烷-乙酸乙酯體積比1∶1]純化得到化合物5(4.6 mg)。將Fr.20-6過反相硅膠柱層析(甲醇-水體積比30∶70)、制備薄層色譜、制備YMC-Pack SIL正相柱(正己烷-乙酸乙酯體積比1∶1)得到化合物6(14.5 mg)。Fr.30 經(jīng)Sephadex LH-20以二氯甲烷-甲醇(體積比1∶1)洗脫得Fr.30-5～Fr.30-6。將Fr.30-5經(jīng)反相硅膠柱層析(甲醇-水體積比20∶80～50∶50)得到 Fr.30-5-4～Fr.30-5-7，將Fr.30-5-4過反相硅膠柱層析(甲醇-水體積比60∶40)純化得到化合物7(1.4 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:淡黃色結(jié)晶(三氯甲烷)。ESI-MS m/z: 393.1[M＋H]＋，分子式為 C28H40O。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ:6.58(1H，d，J＝9.5 Hz，H-7)，6.00 (1H，d，J＝9.6 Hz，H-6)，5.71(1H，s，H-4)，5.20 (2H，qd，J＝15.3，7.7 Hz，H-22，H-23)，2.51(1H，m，Ha-2)，2.43(2H，m，Hb-2，H-17)，2.35(1H，m，H-24)，2.12(2H，dd，J＝15.9，8.0 Hz，H-15)，2.06(1H，m，H-9)，1.99(1H，ddd，J＝13.1，5.2，2.3 Hz，H-20)，1.84(1H，m，Ha-1)，1.77(2H，m，Ha-11，Ha-12)，1.68(1H，ddd，J＝13.5，6.6，3.4 Hz，Hb-12)，1.59 (1H，ddd，J＝14.8，11.5，3.3 Hz，Hb-11)，1.46(1H，m，Ha-16)，1.27(1H，m，Hb-1)，1.22(1H，m，Hb-16)，1.03(3H，d，J＝6.7 Hz，Me-27)，0.97(3H，s，Me-19)，0.93(3H，s，Me-18)，0.90(3H，d，J＝6.8 Hz，Me-21)，0.82(3H，d，J＝6.7 Hz，Me-28)，0.80(3H，d，J＝6.8 Hz，Me-26)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ:199.8 (C-3)，164.7(C-5)，156.4(C-14)，135.2(C-7)，134.3(C-23)，132.7(C-22)，124.6(C-6)，124.6(C-8)，123.2(C-4)，55.9(C-17)，44.5(C-10)，44.2(C-9)，43.1(C-13)，39.5(C-24)，37.0(C-20)，35.8(C-2)，34.3(C-15)，33.3(C-25)，27.9(C-16)，25.6(C-11)，21.4(C-12)，20.2(C-1)，19.9(C-27，C-28)，19.2(C-19，C-26)，17.8(C-21)，16.8(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[3]報道基本一致，鑒定該化合物為Ergosta-4，6，8(14)，22-tetraen-3-one。

化合物2:淡黃色油狀液體(甲醇)。ESI-MS m/z: 163.0[M－H2O]－，分子式為 C10H15NO2。1H-NMR (500 MHz，CD3OD)δ:7.01(2H，m，H-3，H-5)，6.68 (2H，m，H-2，H-6)，4.04(1H，m，Ha-1′)，3.86(1H，m，Hb-1′)，3.67(2H，d，J＝1.9 Hz，H-4′)，2.68(2H，d，J＝6.9 Hz，H-2′)，1.84(2H，m，H-3′)。13C-NMR (125 MHz，CD3OD)δ:156.9(C-1)，131.6(C-3，C-5)，131.1(C-4)，116.2(C-2，C-6)，71.6(C-1′)，60.5 (C-4′)，44.7(C-2′)，40.1(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道基本一致，鑒定為2-[4-(2-aminoethoxy) phenyl]ethanol。

化合物3:淡黃色油狀液體(三氯甲烷)。ESIMS m/z:391.3[M＋H]＋，分子式為 C24H38O4。1HNMR(500 MHz，CD3OD)δ:7.73(2H，dd，J＝5.7，3.3Hz，H-3，H-6)，7.63(2H，dd，J＝5.7，3.3Hz，H-4，H-5)，4.23(4H，m，H-1′，H-1″)，1.71(2H，m，H-2′，H-2″)，1.46-1.30(16H，m，H-3′，H-3″，H-4′，H-4″，H-5′，H-5″)，0.97-0.93(12H，m，Me-6′，Me-6″，Me-8′，Me-8″)。13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ:168.8(—COO—)，133.1(C-1，C-2)，131.89(C-3，C-6)，129.4(C-4，C-5)，68.6(C-1′，C-1″)，39.7(C-2′，C-2″)，31.1(C-3′，C-3″)，29.6(C-4′，C-4″)，24.4(C-7′，C-7″)，23.5(C-5′，C-5″)，13.9(C-6′，C-6″)，10.9(C-8′，C-8″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道基本一致，鑒定為鄰苯二甲酸-二(2-乙基-己基)酯。

化合物4:無色油狀液體(三氯甲烷)。ESI-MS m/z:127.0[M＋H]＋，分子式為 C6H6O3。1H-NMR (500 MHz，CDCl3)δ:9.57(1H，s，CHO)，7.19(1H，d，J＝3.5 Hz，H-6)，6.50(1H，d，J＝3.48 Hz，H-4)，4.70(2H，s，CH2OH)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3) δ:177.9(CHO)，160.7(C-5)，152.6(C-2)，123.0(C-3)，110.2(C-4)，57.9(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道基本一致，鑒定該化合物為5-羥甲基糠醛。

化合物5:無色油狀液體(甲醇)。ESI-MS m/z: 107.0[M＋H－H2O]＋，分子式為 C7H8O2。1H-NMR (500 MHz，CD3OD)δ:6.10(2H，m，H-2，H-6)，6.04 (1H，td，J＝2.2，0.5 Hz，H-4)，2.16(3H，d，J＝0.5 Hz，Me-7)。13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ:159.5(C-1，C-3)，141.3(C-5)，108.7(C-2，C-6)，100.8(C-4)，21.7(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致，鑒定該化合物為3，5-Dihydroxytoluene。

化合物6:淡黃色結(jié)晶(甲醇)。ESI-MS m/z: 137.2[M＋H]＋，分子式為 C8H10O2。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ:7.1(1H，m，H-2)，6.99(1H，m，H-6)，6.68(1H，m，H-3)，6.67(1H，m，H-5)，3.65(2H，J＝7.2 Hz，t，H-8)，2.69(2H，J＝7.2 Hz，t，H-7)。13CNMR(125 MHz，CD3OD)δ:156.9(C-1)，131.2(C-3，C-5)，131.0(C-4)，116.3(C-2，C-6)，64.7(C-8)，39.5 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，鑒定該化合物為對羥基苯乙醇。

化合物 7:白色固體(甲醇)。ESI-MS m/z: 111.0[M＋H]＋，分子式為 C6H8O2。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ:6.32(1H，d，J＝8.0 Hz，H-3)，6.28 (1H，d，J＝2.1 Hz，H-4)，4.61(2H，s，-CH2OH)，2.24 (3H，s，Me-6)。13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ:155.0 (C-2)，141.4(C-5)，105.0(C-3)，103.0(C-4)，57.3 (-CH2OH)，18.7(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，鑒定該化合物為5-甲基-2-呋喃甲醇。

化合物8:白色固體(三氯甲烷)。ESI-MS m/z: 174.9[M＋Cl]－，分子式為 C9H16O。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ:4.10(1H，d，J＝6.7 Hz，H-1)，2.08 (1H，m，Ha-2)，2.02(1H，m，Ha-5)，1.47(1H，d，J＝7.2 Hz，Hb-2)，1.44(1H，d，J＝6.3 Hz，Hb-5)，1.37 (1H，m，H-6)，1.26(3H，s，Me-7)，1.21(3H，s，Me-8)，1.00(3H，d，J＝6.7 Hz，Me-9)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ:131.7(C-3)，129.8(C-4)，72.7(C-1)，54.8(C-2)，31.0(C-6)，30.4(C-5)，24.6(C-7)，19.7(C-8)，16.4(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，鑒定該化合物為3，4，6-trimethylcyclohex-3-en-1-ol。

4 細胞毒活性測試

采用SRB法[11]測定粗提物細胞毒活性。取對數(shù)生長期的HepG-2、NCI-H460、SF-268、MCF-7細胞，用胰酶消化，臺盼藍染色計數(shù)，臺盼藍排斥實驗檢測細胞活力大于95%后，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為3 ×104個/mL，細胞接種于96孔板，每孔加入細胞懸液180 μL，并設(shè)3個空白孔調(diào)零，于37℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，每孔加入20 μL待測樣品，陰性對照加20 μL培養(yǎng)基，以順鉑作陽性對照。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入質(zhì)量分數(shù)50%冷三氯醋酸50 μL固定細胞，4℃放置1 h后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后加入由1%(質(zhì)量分數(shù)，下同)冰醋酸配制的4 mg/mL SRB溶液(100 μL/孔)，室溫中染色30 min，去上清，用1%冰醋酸洗滌5次，空氣干燥。最后加入10 mmol/mL的Tris溶液(200 μL/孔)，用酶標儀測定570 nm處的吸光值(A)，用公式:細胞生長抑制率＝[A空白對照組－A樣品組]/A空白對照組×100%，計算粗提物對細胞生長的抑制率。結(jié)果顯示其他化合物在100 μmol/L濃度下，對4種腫瘤細胞的抑制率均低于20%，幾乎沒有活性，而化合物1對4種腫瘤細胞均有顯著的抑制作用，見表1。

表1 化合物1對4種腫瘤細胞株的IC50值Table 1 IC50values of compound 1 against four tumor cells lines (±s，n＝3)

表1 化合物1對4種腫瘤細胞株的IC50值Table 1 IC50values of compound 1 against four tumor cells lines (±s，n＝3)

化合物IC50/(μmol·L－1) SF-268 MCF-7 NCI-H460 HePG-2120.84±0.75 15.31±0.27 13.62±0.71 25.45±0.66順鉑 1.93±0.16 5.87±0.45 1.32±0.15 1.75±0.17

5 討論

平臍蠕胞屬(Bipolaris)真菌是一類寄生多種植物或生于多種植物基質(zhì)，分布廣泛，具有重要經(jīng)濟意義的真菌類群[12]。本文從分離自廣藿香內(nèi)生真菌索氏平臍蠕孢Bipolaris sorokiniana A606的發(fā)酵液中分離并鑒定了8個化合物，其中化合物1～4、7～8均為

首次從該屬真菌中分離得到。化合物1具有抗腫瘤[13]、利尿[14]、免疫調(diào)節(jié)等活性[15]，對慢性腎衰竭具有保護作用[16]，本文結(jié)果也表明該化合物對4種腫瘤細胞株具有顯著的抑制作用。化合物6為橄欖油中酚類化合物的主要成分，具有多種生物活性[17]。

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(責任編輯:陳翔)

Study on secondary metabolites of endophytic fungus Bipolaris sorokiniana from Pogostemon cablin and their antitumor activities

WANG Mo1，2，CHEN Yuchan2，LI Haohua2，SUN Zhanghua2，TAN Guohui2，YAN Hanjing1，ZHANG Weimin2，GUO Xiaoling1

(1.Central Laboratory，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China，Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of Applied Micrbiology，Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510070，China)

ObjectiveTo study the active secondary metabolites of the endophytic fungus Bipolaris sorokiniana，A606 isolated from Pogostemon cablin and their antitumor activities.MethodsThe compounds were isolated and purified from the ethyl acetate extract of the strain A606 fermentation broth by silica gel，reverse phase silica gel，Sephadex-LH20，high performance liquid chromatography and preparative TLC.Their structures were identified by extensive analysis of their spectroscopic data.All isolated compounds were evaluated for their cytotoxic activities against human tumor cell lines by the SRB assay.ResultsEight compounds were isolated and identified as Ergosta-4，6，8(14)，22-tetraen-3-one(1)，2-[4-(2-aminoethoxy)phenyl]ethanol(2)，Di-(2-ethylhexyl)phthalate(3)，5-(hydroxymethyl)furan-2-carbaldehyde(4)，3，5-Dihydroxytoluene(5)，2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol(6)，(5-methylfuran-2-yl) methanol(7)，3，4，6-trimethylcyclohex-3-en-1-ol(8).Compound 1 showed cytotoxic activity against four tumor cell lines SF-268，MCF-7，NCI-H460 and HepG-2 with IC50values of 20.84，15.31，13.62 and 25.45 μmol/L，respectively.Conclusion Compounds 1～4、7～8 were isolated from the genus Bipolaris for the first time.Compound 1 displayed the significant cytotoxic activity.

Bipolaris sorokiniana；endophytic fungus；Pogostemon cablin；cytotoxic activity

R284.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.004

1006-8783(2015)05-0576-05

2015-09-02

國家 973前期專項項目(2014CB460613)；國家自然科學基金項目(81203006)；廣東省自然科學基金項目(2015A030313710，S2012010009773)

王沫(1989—)，女，2013級碩士研究生，從事微生物天然產(chǎn)物研究，Email:wangmo1989111＠126.com；通信作者:章衛(wèi)民(1965—)，男，博士，研究員，從事藥用微生物資源及其活性物質(zhì)，電話:020-87688309，Email:wmzhang58＠qq.com；郭曉玲(1961—)，女，副教授，從事藥物分析、中藥新劑型及質(zhì)量控制研究，電話:020-39352523，Email:13922409242 ＠163.com。

時間:2015-09-28 15:28

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150928.1528.008.html