發酵法制備黃芪藥渣飼料添加劑活性物質

竺利紅，焦巧芳，尹小良，張 紅，施躍峰*

（1.浙江省農業科學院a植物保護與微生物研究所，b浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江杭州 310021；2.趙縣農牧局，河北石家莊 051530；3.紹興市越城區東湖鎮農業綜合服務中心，浙江紹興 312001；4.浙江省醫學科學院，浙江杭州 310013）

發酵法制備黃芪藥渣飼料添加劑活性物質

竺利紅1ab，焦巧芳2，尹小良3，張 紅4，施躍峰1ab*

（1.浙江省農業科學院a植物保護與微生物研究所，b浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江杭州 310021；2.趙縣農牧局，河北石家莊 051530；3.紹興市越城區東湖鎮農業綜合服務中心，浙江紹興 312001；4.浙江省醫學科學院，浙江杭州 310013）

以黃芪藥渣為發酵底物，以棘孢木霉為發酵菌種，制備中藥渣飼料添加劑，檢測產物中各類活性物質。結果表明，黃芪藥渣經棘孢木霉發酵后，能產生以β-葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶為主的豐富酶系；與發酵前相比，黃芪甲苷在發酵液中的釋放量增加了4倍；發酵產物對變形桿菌、沙門氏桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等細菌有較強的抑制作用。表明利用棘孢木霉發酵黃芪藥渣制備飼料添加劑具有較好的開發潛力。

黃芪；棘孢木霉；發酵；黃芪甲苷

黃芪為豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的根，是中醫臨床最常用的大宗藥材之一。黃芪的主要活性物質為黃芪皂苷、黃酮、多糖、單糖等，具有補氣升陽、益氣固表、托毒生津和利水消腫功效，在獸醫臨床上可用于防治雞傳染性法氏囊病，提高蛋雞產蛋率和飼料報酬、降低淘汰死亡率，提高肥育豬的生長和屠宰性能，改善肉的品質［1-2］。

目前黃芪及復方制劑的提取方法主要是醇提法和水提法，產生的黃芪藥渣仍含有豐富的活性物質，可作為飼料添加劑被再次利用［3］。目前中草藥渣在飼料添加劑中的運用大多采用干燥粉碎后按一定比例直接添加到飼料中的方法。藥渣中活性成分、蛋白質等營養元素往往包裹在細胞壁內，植物細胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質、木質素等物質構成的致密結構，除草食動物外，其他動物不能消化吸收纖維素、半纖維素等物質。因此，藥渣作為飼料添加劑直接添加，對非草食動物而言，活性成分和營養元素并不能被很好地吸收，導致其在飼料中添加量大增，在浪費資源的同時也破壞了飼料的營養配比，甚至大多數情況下因添加量太大而無法配制；同時，藥渣中主要組成部分纖維素和半纖維素等也因為無法被非草食動物吸收而造成浪費。

微生物在代謝過程中可分泌蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等幾十種胞外酶進入培養基，不僅可以水解植物細胞壁的纖維素、半纖維素、果膠質等，將它們轉化成動物和人體可直接利用的小分子糖、單糖、多肽和氨基酸等，提高營養成分，還可以使植物細胞破裂，有利于有效成分和營養物質溶出；同時微生物自身還能產生豐富的次生代謝產物，它們中的一些活性物質可與中藥有效成分發生協同作用擴大藥效。本試驗利用棘孢木霉（Trichoderma asperellum）發酵黃芪藥渣制備飼料添加劑，并對其活性物質展開了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

1.1.2 培養基

肉湯培養基。蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 2.5 g，K2HPO42.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，調pH值7.0。

PDA培養基。馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂18 g，水1 L，pH值自然。

藥渣培養基。黃芪藥渣1 g，麩皮1.4 g，淀粉1.4 g，水35 m L，pH值5.5。

對照培養基。麩皮1.4 g，淀粉1.4 g，水35 mL，pH值5.5。

1.2 方法

1.2.1 黃芪藥渣的制備

取黃芪150 g，加600 mL蒸餾水浸泡30 min，煮沸20 m in，倒掉浸煮液；再加600 m L蒸餾水繼續煮沸20 m in，倒掉浸煮液；105℃烘干2 h至恒重，粉碎，過60目篩。

普陀區桃浦鎮北環水系長度約為3500m，寬度為8～18m，水域面積為 4.1×104m2，水域深度為 0.7～2.5m。在對水質特點進行分析時，發現由于受到多年工業廢水、生活污水以及雨污混流等因素的影響，導致水域內的污染物嚴重積累，河水的流動性相對較差，甚至出現季節性“黑臭”的問題，嚴重影響了城市美觀。雨季時，會有大量的雨水和污水流入，經過2015年清淤處理后，雖然可以接納一定點源以及面源污染物，但仍有大量的污染物進入河道內，影響了河道排污口的排污效果。實地考察結果顯示，河道內依然有少量魚群存活，河道兩側有少量挺水植物生長，整個河道內并無任何沉水植物生長。

1.2.2 黃芪藥渣發酵液的制備

取新鮮培養的棘孢木霉PDA斜面，刮下孢子，用無菌生理鹽水制成濃度為1×108mL-1的孢子懸浮液。按3%的接種量接入藥渣培養基中，28℃，200 r·min-1，振蕩培養120 h。然后9 000 r·min-1離心10 m in，取上清液，備用。

1.2.3 酶活性測定

取上述上清液，檢測羧甲基纖維素鈉酶（CMC酶）、濾紙酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和果膠酶的活性，具體測定方法參照文獻［4-8］。

1.2.4 黃芪甲苷含量測定

取上清液15 m L，用10 m L水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇層。用15 m L 1%NaOH溶液洗滌2次，15 m L水飽和正丁醇洗滌2次至中性。80℃水浴蒸干正丁醇層，用3 m L甲醇溶解，0.45μm濾膜注射過濾后用于HPLC測定。色譜柱采用Sunfire柱，流動相為乙腈∶水43∶57，流速為1 mL·min-1，檢測波長203 nm，進樣量為10μL。配制黃芪甲苷標準品濃度為0.5 mg·mL-1。測定樣品及標準品的峰面積，藥渣發酵液中黃芪甲苷的含量計算公式：

式中C為樣品中黃芪甲苷含量，A為樣品HPLC圖譜的峰面積；B為標準品HPLC圖譜的峰面積。

1.2.5 抑菌活性測定

采用杯碟法。將0.1 m L檢測菌液（菌數約為107m L-1）均勻涂在肉湯固體平板上，室溫干燥30 m in后，將牛津杯（內徑為6 mm）均勻放置在平板上，吸取0.1 m L藥渣發酵上清液于杯中，37℃培養24 h，測量抑菌圈直徑。各重復3次，取平均值。設置2個對照，CK1為牛津杯中添加沒有接菌的空白藥渣培養基上清液，CK2為棘孢木霉在對照培養基上的發酵上清液。

2 結果與分析

2.1 酶活性

棘孢木霉在黃芪藥渣培養基上培養48，60，72，84和96 h時，分別測定CMC酶、濾紙酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和果膠酶的活性，測定結果見表1。結果表明，棘孢木霉能在含有黃芪藥渣的培養基上較好地生長并產生豐富的酶系，培養60 h時，CMC酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶的最大酶活性均超過1 000 U·m L-1。

表1 不同培養時間的酶活測定結果U·m L-1

2.2 黃芪甲苷

黃芪甲苷標準品的HPLC圖譜顯示，本研究中HPLC系統的黃芪甲苷吸收峰出現在第4 min（圖1）。因此，通過計算試驗樣品HPLC圖譜在第4 min的吸收峰面積，可以得出黃芪藥渣發酵液中黃芪甲苷的含量。結果表明，黃芪藥渣發酵0，60，72，84，96和120 h后，其上清液中黃芪甲苷的含量分別為（0.11±0.027）%，（0.22±0.003）%，（0.28±0.014）%，（0.41±0.036）%，（0.57± 0.027）%和（0.53±0.041）%，表明黃芪藥渣經棘孢木霉發酵后，細胞壁被降解和破壞，胞內的黃芪甲苷被逐步釋放出來，發酵96 h時黃芪甲苷含量達到最高。

2.3 抑菌活性

取發酵96 h的藥渣發酵液，檢測其對變形桿菌、沙門氏桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌5種常見細菌的抑菌活性，結果如表2所示。棘孢木霉和黃芪藥渣對5種細菌的抑菌圈直徑均為0 mm，表明棘孢木霉和黃芪藥渣本身沒有抑菌活性；而黃芪藥渣發酵液對5種細菌的抑菌圈直徑為19.1～29.9 mm，表明黃芪藥渣經過棘孢木霉發酵后發酵液中產生了具有抑菌作用的活性物質。

圖1 黃芪甲苷標準品HPLC圖譜

表2 藥渣發酵液的抑菌活性

3 小結與討論

棘孢木霉能在含有黃芪藥渣的培養基中較好地生長，而且能產生β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠酶、濾紙酶和CMC酶等，這些酶不僅可以降解黃芪藥渣的細胞壁，釋放出胞內殘留的黃芪甲苷，還能將細胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠質等轉化為動物可直接利用的小分子糖、單糖、多肽和氨基酸等，提高營養成分，促進動物對飼料中營養物質的吸收。同時棘孢木霉自身還能產生豐富的次生代謝產物，其中的一些活性物質可以與黃芪的有效成分發生協同作用擴大藥效，產生較好的抑菌活性。本文僅對添加棘孢木霉的黃芪藥渣發酵液的活性物質作了初步的研究，接下來將進一步改良菌種，改進發酵工藝，提高各類活性物質在發酵產品中的產量，并擴大中藥渣的種類，研制出新型飼料添加劑，以滿足市場的需求。

［1］ 梅洪睿，云霞，楊紅，等.黃芪中主要活性成分的分離提取研究進展［J］.分析試驗室，2008，27（z2）：242-243.

［2］ 朱志剛，胡建剛，章華其，等.中草藥飼料添加劑對肥育豬生長和肉質的影響［J］.浙江農業科學，2011（2）：423-425.

［3］ 黃小光，鄺哲師.中藥渣作為飼料添加劑的應用［J］.廣東飼料，2007，16（6）：32-33.

［4］ Horikoshi K，Nakao M，Kurono Y，et al.Cellulases of an alkalophilic Bacillus strain isolated from soil［J］.Canadian Journal of Microbiology，1984，30（6）：774-779.

［5］ Ghose T K.Measurement of cellulase activities［J］.Pure and Applied Chem istry，1987，59（2）：257-268.

［6］ Goodenough P W，Kekos D，Macris B J.Purification and characterization of an extracellularβ-glucosidase with transglycosylation and exo-glucosidase activities from Fusarium oxysporum［J］.European Journal of Biochem istry，1994，224（2）：379-385.

［7］ 張潔，蔡敬民，潘仁瑞.芽孢桿菌木聚糖酶測定條件研究［J］.微生物學雜志，1997（2）：33-34.

［8］ 童娟.果膠酶高產菌株AspT7的分離及篩選鑒定［J］.西華大學學報：自然科學版，2012，31（6）：102-105.

（責任編輯：侯春曉）

S 816.7

：A

：0528-9017（2015）10-1651-03

文獻著錄格式：竺利紅，焦巧芳，尹小良，等.發酵法制備黃芪藥渣飼料添加劑活性物質［J］.浙江農業科學，2015，56（10）：1651-1653.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151043

2015-05-14

竺利紅（1973-），女，浙江嵊州人，副研究員，碩士，主要從事微生物農藥研究工作。E-mail：zhulh@mail.zaas.ac.cn。

施躍峰。E-mail：shiyf2003@sina.com。