云南省杉木優良無性系組培快繁育苗技術研究

張建華

摘要：對云南省杉木優良無性系組培快繁育苗技術進行了研究，從不同的材料采集和誘導培養、繼代增殖培養、壯苗培養、生根培養、煉苗和移栽等方面分析了不同條件下苗木的移栽效果，為杉木無性系組培快繁育苗，提供重要的參考價值。

關鍵詞：杉木；優良無性系；育苗

中圖分類號：S791.27 文獻標識碼：B 文章編號：1674-9944（2014）04-0077-07

1、引言

杉木（Cunninghamia Lanceolata Hook）是我國特有的用材林樹種。生長快、材質好、用途廣、產量高，是林農喜歡種植的造林樹種。在1000多年的種植過程中，經過不斷的雜交與選擇，留下了很多表現較好的優良無性系。為加快這些優良無性系在林業上的繁殖應用，紅河州國營芷村林場在云南省率先開展了對杉木優良無性系組培快速繁殖育苗技術研究。經過近三年多的不斷探索，總結出了適合云南省杉木優良無性系組培快速繁殖育苗的技術成果。

2、材料與方法

2.1 材料

（1）從福建省洋口國有林場優良無性系中選擇“洋林020”、“洋林061”、“洋林062”。

（2）從本地優良無性系中選擇4個（暫編“紅林001”，“紅林002”、“紅林004”和“紅林005”。

2.2 方法

根據前人的研究結果，基本培養基以MS培養基為基礎稍作改良，培養pH值為5.8，卡拉膠5g/L，激素濃度單位為mg/L，培養條件為（25±2）℃，光照12～14h/d，光照強度16001x。各試驗均進行3次重復，表中數據均為3次重復的平均值，方差分析用計算器計算獲得。

2.2.1 試驗基本流程

①材料采集；②外植體表面滅菌；③誘導培養；④繼代增殖培養；⑤壯苗培養；⑥生根培養；⑦出室煉苗；⑧移栽培育和栽后管理；⑨建立生產技術體系。

2.2.2 試驗方法

（1）材料采集。材料采集自優良無性系母樹靠基部的萌芽條。采集時間分為干季（當年10月之后，來年5月雨季來之前）和雨季兩種，一般在下午進行采集，根據試驗結果對采集時間進行選擇。

（2）外植體表面滅菌。材料采回后，剪去全部針葉（葉柄基部留2～3mm短柄），然后切成2～6mm的帶芽莖段，用洗潔精或洗衣粉洗3～5min，用流水沖洗2～3h，再用0.08%～0.12%HgCl，進行滅菌，最后在超凈臺用無菌水清洗8～10次，根據試驗結果對滅菌時間進行調節優化。

（3）誘導培養（初代培養）。對外植體表面進行清洗后，先將莖的一端或兩端切去少許，再將剩下部分切成2cm左右的帶芽莖段接入不同的誘導培養基中進行腋芽誘導培養。培養基采用3/4MS，蔗糖2%，添加的KT濃度為0.3～1.2mg/L，NAA濃度為0.05～0.15mg/L。接種完成后先進行暗培養72h，再進行光照培養，光照時間12h/d，各處理按40d的出芽指數（發生芽的外植體上的平均出芽數）、芽平均高（全部芽長度總和除以芽總數）、誘導率進行統計結果，再根據結果對誘導培養基進行調節優化。

（4）繼代增殖培養。初次培養40～50d后，新芽長到2cm以上時，即可將其轉入繼代培養基中進行培養，培養基采用3/4MS，蔗糖3%，6-BA濃度為0.1～0.7mg/L，NAA濃度為0.01～0.1 mg/L，各處理按40d的出芽指數（發生芽的外植體上的平均出芽數）、芽平均高（全部芽長度總和除以芽總數）統計結果，根據試驗結果對繼代培養基進行調節優化。

（5）壯苗培養。繼代培養40d后，剪取繼代苗中高2～3cm，生長健壯的芽接入壯苗培養基中進行培養，基本培養基采用1/2～3/4MS，NAA的濃度為0.03～0.06 mg/L，蔗糖濃度2%，碳粉濃度0.5g/L，根據試驗結果對壯苗培養基進行調節優化。

（6）生根培養。在繼代培養40d后或壯苗培養30d后的瓶苗中，選取高3cm以上，生長健壯的植株為材料進行生根試驗，基本培養基采用1/2MS，蔗糖濃度2%，NAA的濃度為0.01～0.03 mg/L，NAA的濃度為5～15 mg/L，各處理按40d的生根指數（發生芽的外植體上的平均出根數）統計結果，根據試驗結果對生根培養基進行調節優化。

（7）黃化率控制。組培過程中，組培苗黃化是一個值得重視的問題，輕者可影響繁殖速度，重者可導致整個組培生產的失敗。分別選擇不同培養基配制用水、不同生長素NAA的濃度和不同接種人員等因素作對比試驗，通過試驗進行優化選擇。

（8）出室煉苗。經過生根培養30d以上的苗便可進行出室煉苗和移栽，煉苗時間一般15～20d。

（9）移栽及栽后管理。移栽基質選擇生土、輕基質或熟土。基質在使用前用3%的高錳酸鉀溶液進行充分消毒滅菌，移栽后除及時澆水外，應在苗床上搭建小拱棚和拱棚上加蓋50%遮陰網。

移栽后10d左右，噴施一次生根促進劑、一次殺菌劑。以后每隔一周施一次殺菌劑，并注意保溫保濕。這樣管理到1個月（冬季可到2～3個月）后，先在下午打開棚門，早上關上，5～7d后選擇一個陰天拆除拱棚和遮陰網，以后就按一般苗木進行管理。

2.2.3 適合產業化組培育苗杉木無性系的選擇

根據外植體的誘導率、繼代增殖倍數、繼代苗生長速度、生根率、移栽后的生長情況對杉木無性系進行篩選，本試驗選擇7個杉木優良無性系進行試驗，根據試驗結果進行選擇。

3、結果與分析

3.1 材料采集與誘導培養

3.1.1 采集季節、天氣條件和滅菌時間對外植體誘導的影響

試驗結果列于表1。從表l中可以看出，誘導培養中萌芽條采集的季節、氣候條件和表面滅菌時間對誘導結果有很大的影響。一般是：干季、晴天采集的萌芽條比較容易滅菌，污染率為37.7%，誘導率達40.8%，而濕季采集的萌芽條比較難滅菌，污染率達52.3%，誘導率26.05%。特別是陰雨天采集來的萌芽條最難滅菌，污染率達到71%，誘導率僅有8.3%%。干季、晴天采集的萌芽條采用8～10min較好，而夏季、雨水天采集的萌芽條需要10～12min較好。用0.1%HgCl₂滅菌可達到理想的效果。

3.1.2 KT濃度對外植體誘導和新芽生長的影響

培養基是組培苗木生長的土壤，培養基中的激素濃度對芽的誘導和生長具有重要的作用。表2列出了5種培養基對芽的誘導和生長的影響。從表2可知，添加不同濃度的細胞分裂素KT的培養基、外植體的萌動率和生長狀況有較大的差異。從誘導率和萌芽率來看，一般在0.5～0.8mg/L之間誘導效果較好。

3.1.3 不同無性系對誘導結果的影響

誘導結果除受培養條件的影響外，還受本身基因型條件的影響。表3列出了3個無性系在同一培養條件下的試驗結果，從表3可以看出，無性系在誘導率、生長速度和平均出芽個數之間存在較大差異。以洋林020無性系的誘導率最高，新芽生長速度最快，平均出芽數也最多，分別比平均值高8.3%、0.4%、0.75%。

通過對7個無性系的誘導試驗結果進行方差分析（表4）表明，在同一培養條件下，不同無性系之間的誘導率達到極顯著差異水平，而各重復之間無顯著差異。

3.2 繼代增殖培養

3.2.1 KT和NAA對繼代增殖培養的影響

表5列出了KT和NAA濃度配比對繼代增殖培養的影響，繼代增殖倍數以3代后計算，繼代增殖倍數為：每個芽處理的總數/第一次轉接時芽個數/繼代次數。

從表5中可以看出，隨著激素總濃度的增加，芽的生長速度逐漸減慢，叢生芽比例增多，有效苗比例減少。KT濃度保持不變時，隨著NAA濃度的增高叢生芽的高生長速度稍有減慢，當NAA濃度為0.05mg/L時，芽的高生長有明顯減慢，NAA濃度保持在0.03～0.05mg/L時效果較好；當NAA濃度保持不變時，隨著KT濃度的增高，叢生芽數量增多，芽的高生長減少，有效苗的比例減少，當濃度在0.7mg/L以上時，叢生芽出現較輕微的玻璃化現象，叢生芽的高生長受到抑制，KT應保持在0.3～0.5mg/L時效果較好。

從上述分析可知，生長素NAA主要影響繼代增加殖苗的高生長，細胞分裂素KT主要影響繼代增殖的倍數。同時，由于繼代增殖培養次數的增加，繼代苗中的激素會出現累積，所以，隨著繼代次數的增加，應逐漸減少培養基中的激素濃度。

3.2.2 大量元素濃度對繼代增殖培養的影響

在組織培養中，不同各植物甚至同種植物的不同無性系之間所需的營養元素的種類、濃度及其比例都不同，通過對杉木繼代增殖培養基中大量元素濃度進行試驗，結果見表6。

從表6中可以看出，培養基中大量元素濃度對繼代苗的生長有重要影響，MS濃度過高時，連續培養2代以上后苗木會逐漸出現變黃死亡；而過低時，繼代苗會隨著繼代次數的增加逐漸變細變弱；培養基大量元素濃度一般保持在1/2～3/4MS之間較適合。

3.2.3 不同無性系對繼代增殖培養的影響

在同一培養條件下，對無性系進行繼代增殖培養對比試驗，試驗結果表明：各無性系的生長增殖有較大的差異，其中以洋林020的長勢較好，增殖倍數較高，明顯優于其它無性系。通過對7個無性系的繼代增殖試驗結果進行方差分析（表7）表明，7個無性系之間的繼代增殖倍數差異達到極顯著水平，說明無性系的繼代增殖倍數受自身基因型的影響，增殖速率存在著真實差異；同時，不同重復間的增殖倍數也達到顯著的差異，說明同一個無性系，在不同的繼代代數之間，由于苗木幼化程度、組織分生能力的不同，其增殖倍數也會有差異。

由上述分析可知，在做杉木繼代增殖時，一個繼代增殖培養基一般只適合于一個無性系的繼代增殖培養，且同一無性系，在不同代數的繼代增殖培養中，培養基也需要進行適當微調。

3.2.4 繼代增殖苗的黃化控制

（1）培養基配制用水對組培苗黃化的影響。表8列出了5種水質對培養基pH值及組培苗黃化的影響情況，從表8中可以看出，5種不同質地的水主要通過影響滅菌后的培養基pH值進而影響到組培苗的生長。其中，以用蒸餾水配制的培養基黃化率最低，僅7.45%，過濾水次之，為7.58%；以用地下水（井水）配制的培養基黃化率最高，達到了31.47%，自來水次之，為28.73%。

（2）生長素NAA濃度對組培苗黃化的影響。表9列出了NAA的5種不同濃度對組培苗黃化的影響情況，從表9中可以看出，在增殖培養基中添加不同濃度的生長素NAA會對組培苗的黃化有影響。通過對5種濃度NAA黃化率的試驗結果進行方差分析（表10）表明，當NAA濃度達到0.1mg/L以上時繼代苗的黃化現象達到極顯著的程度。一般適宜添加濃度在0.03～0.06mg/L之間。

（3）不同接種人員對組培苗黃化的影響。表11列出了10個不同接種人員對苗木黃化率的影響情況。從表11中可以看出，不同的接種人員，因技術熟練程度不一樣，接種出的繼代增殖苗黃化率有較明顯的差異，最低的1.94%，最高的可達15.6%。

3.3 壯苗培養

通過壯苗培養試驗，結果表明壯苗培養基與繼代增殖培養基一樣，不同的無性系需要不同的壯苗培養基。洋林020用3/4MS+NAA 0.03mg/L+蔗糖2%培養基進行壯苗培養效果較好；而洋林061、洋林0.62、紅林001、紅林002、紅林004和紅林009無性系則用1/2 MS+NAA 0.05mg/L+蔗糖2%培養基進行壯苗培養效果較好。

3.4 生根培養

3.4.1 單一生長素對生根的影響

表12列出了培養基中添加單一激素IAA、IBA和NAA等對生根的影響，從表12中可看出：3種激素的生根培養基對生根有比較明顯的促進作用，生根率得到提高，從17.8%提高到76.5%，生根時間縮短。其中添加生長素IBA的生根培養基生根率較高，IBA的濃度為5～10mg/L時生根率為38.6%～76.5%，生根所需時間較短，一般在25d左右，而且根長適中；添加生長素NAA的生根培養基中，生根效果較差，生根所需時間較長；另外，從表12中還可看出生根率隨著所添加的激素濃度變化而變化，組培苗的生根率隨著培養基中激素濃度的增高而提高，IAA、IBA在5～10mg/L時效果比較好，生根率較高，生根所需時間較短，當濃度超過10mg/L時生根率下降，NAA在0.05～0.1mg/L時效果比較好，超過O.1mg/L時生根率下降。

3.4.2 多種生長素對生根的影響

生根培養基中單一生長素，生根效果不太理想，生根率不高，生根所需時間較長。表13列出了三因素三水平正交試驗9個處理對組培苗生根的影響，從表13中可以看出，不同處理之間組培苗的生根率差距比較大，處理5的生根率最高，達到80.7%，處理1和處理8最低，只有26.9%；不同處理之間的生根時間、平均根數和平均根長存在著一定差異，基本都在30d，平均根數1.82條，平均根長1.62cm。經對試驗結果進行方差分析（表14）表明，各處理之間的差異達到極顯著水平，重復之間差異不顯著，說明生根率在不同濃度和比率的生長素的培養基中存在著差異；同時由方差分析表15可知，生長素之間的交互效應和生長素NAA對生根率的影響達到極顯著差異水平，說明了各生長素的濃度和它們之間的比率以及NAA的濃度對組培苗的生根影響較大。

由以上試驗及分析可知，杉木組培苗生根的生理過程較為復雜，在這過程中對培養基添加生長素有較嚴格的要求，一般添加IBAI～3mg/L、NAA0.05～0.08mg/L和IAA2～5mg/L的培養基生根效果比較理想。

3.5 煉苗及移栽

生根瓶苗在培養室培養到30d左右，當根長約0.5cm時轉移到過渡性溫室大棚中進行煉苗，煉苗約15d當小苗長到4cm以上，根長約1.5cm且根系發達，葉色濃綠時，用高錳酸鉀消毒水進行培養基清洗，然后移栽到經過消毒的苗床中，移栽完成后澆透水，并在苗床上加蓋棚膜和遮陽網。在煉苗過程中，因云南省大部分地區氣候較干燥，空氣濕度明顯不足，要注意不要開瓶煉苗，可將煉苗時間適當延長。

3.5.1 不同基質對移栽效果的影響

不同的基質對移栽效果有較明顯的影響，表16列出了不同基質對移栽效果的影響情況，從表16中可以看出：不同基質的移栽效果不同，以生土的移栽效果最好，成活率達到95%，以熟土的成活率最低，只有64%。

3.5.2 不同移栽季節對移栽效果的影響

不同的移栽季節（在云南主要分為旱季和雨季）對移栽效果有較明顯的影響。表17列出了不同移栽季節用生土和輕基質移栽的效果情況。從表17中可以看出，不同的季節移栽效果差異較大，以旱季用生土移栽的效果最好，成活率達到97%，以雨季用輕基質移栽的效果最差，成活率只有32%。

另外，在移栽基質選擇中還應注意：生土肥分較差，保水性一般，應勤施肥；輕基質保水性差，肥分一般，應注意保潮；熟土肥分和保水性較好，但含雜菌較多，應注意做好消毒滅菌工作。

3.6 組培苗木生產技術體系的建立

組培苗木要進行大規模工廠化生產，需要在技術上進一步完善，才能達到工廠化育苗的水平，對已經進行組培快繁技術研究的杉木優良無性系新品種需要進一步篩選，使篩選出來的無性系能在林業建設中發揮更大的作用。

從表18中可以看出，7個參試的無性系中，以洋林020最適合組培生產，其次為紅林005。

4、小結與討論

（1）通過上述分析可以看出，在云南省以杉木優良無性系進行組培養育苗，在選擇好較適合組培的杉木優良無性系后，材料采集時盡量在干季、晴天，采下的材料用0.1%HgCI滅菌10～12min；誘導培養采用3/4MS+KT0.5～0.8mg/L+Vc50mg/L+C1000mg/L+糖30%作培養基；繼代增殖培養用3/4MS+KT0.1～0.3mg/L+NAA0.03～0.05mg/L+VcS0mg/L+糖30%作培養基；壯苗培養用3/4MS+NAA O.03mg/L+蔗糖2%作培養基；生根培養用1/2MS+IBA3～5mg/L+IAA2～5mg+NAA0.05～0.08mg/L+Vc50mg/L+糖20%作培養基；培養條件為溫度25±20C，光照12～14h/d，光照強度16001x；煉苗時問10～15d，可視情況開蓋煉苗2d；移栽時選擇少雨的冬春季節，用生土或輕基質作移栽基質，對土壤充分殺菌消毒，并在苗床上加蓋棚膜和50%遮陽網以確保組培苗的成活。

（2）云南省各地水源中，水質呈微堿性或堿性的較多，且離子濃度較高，不能直接用作配制培養基的用水，應選用去離子水或純水。

（3）在杉木組培育苗過程中，應注意控制污染苗、黃化苗的發生比例以確保組培生產的順利進行。

（4）杉木優良無性系組織培養育苗技術作為一項新興的育苗技術，技術性較強，但這項技術的應用對林業生產具有重大意義。①無性系組培育苗可縮短杉木優良品種的苗木繁育期，盡快為林業生產提供優質苗木，解決林業上使用良種苗“難”的問題。②組織培養所用繁殖材料少，繁殖速度快，能在短時期內為林業繁育出大量可供造林的優質苗木，解決林業上使用良種“貴”的問題。③組培育苗也稱工廠化育苗，大部分工作在室內完成，育苗不受季節影響，可全年進行生產。④組培育苗繁殖后代整齊一致，并能保持原有品種的優良性狀，一方面造林密度可以降低，可減少部分造林、撫育投資，另一方面為林業上營造高品質杉木林分，創造高效林業打下基礎。⑤組培培育的杉木小苗移栽入營養袋后可培育成袋苗，在造林上可少受自然環境中惡劣天氣的影響。⑥杉木無性系組培快繁育苗技術在林業上的推廣應用，可帶動行業中對其他樹種優良品系的繁殖育苗，從而加快林業的良種化發展。