左旋紫草素轉化工藝*

周健，郭瑞霞，王汝興，趙桂琴

(1.承德醫學院中藥研究所、河北省中藥研究與開發重點實驗室，承德 067000；2.石家莊學院化工學院，石家莊 050017)

左旋紫草素轉化工藝*

周健1，郭瑞霞2，王汝興1，趙桂琴1

(1.承德醫學院中藥研究所、河北省中藥研究與開發重點實驗室，承德 067000；2.石家莊學院化工學院，石家莊 050017)

目的研究紫草總色素轉化為左旋紫草素的最佳工藝條件。方法采用L9(34)正交實驗法，以左旋紫草素轉化率為指標，優選轉化溫度、轉化時間、2%氫氧化鈉的體積與紫草總色素的質量比。結果溫度35 ℃，轉化時間4 h，2%氫氧化鈉的體積與紫草總色素的質量比例為4.5 mL·mg-1時，紫草素轉化率最高，平均轉化率為64.86%。結論該優選工藝方便簡便，經濟環保，適合工業化生產。

紫草總色素；左旋紫草素；正交實驗

紫草為紫草科紫草屬草本植物，分為新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst.和內蒙紫草ArnebiaguttataBunge。本品味苦、性寒，長于活血、涼血、解毒，為傳統中藥材[1]。紫草的有效化學成分主要分為兩類：一類是水溶性成分，主要是多糖，含量約2%[2]；另外一類是脂溶性很強的萘醌類紫草總色素[3]，包括左旋紫草素、去氧紫草素、乙酰紫草素、β-羥基異戊酰紫草素等[4]。紫草總色素有抗病原微生物、抗炎、抗過敏、解熱、抗腫瘤及止血等藥理作用[5]，其中左旋紫草素為主要活性成分[6]。在有關紫草素的制劑中左旋紫草素為主要檢測指標，但是目前的研究報道大多局限于紫草總色素的提取分離方法，而忽略了總色素中左旋紫草素的含量，從而影響了紫草總色素藥效的發揮。本實驗就這一問題進行了系統的研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀；HP-8453型紫外-可見分光光度儀；旋轉蒸發儀(日本東京理化EYELA)；DZKW-C電子恒溫水浴鍋(北京光明醫療儀器廠)。

1.2 試藥 左旋紫草素，購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110769-200204)；新疆紫草，購自中國藥材集團承德藥材有限公司，由承德醫學院趙桂琴教授鑒定為新疆紫草[Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst]的干燥根；甲醇，色譜純；乙醇，石油醚均為分析純；氫氧化鈉為分析純。

2 方法與結果

2.1 左旋紫草素提取及堿轉化工藝 紫草50 g粉碎至粗粉，加入95%乙醇400 mL，于45 ℃保溫浸提15 h，濾過，濾渣加入95%乙醇400 mL，于45 ℃保溫浸提8 h，濾過，合并2次濾液，減壓回收乙醇，得250 mL濃縮液，由紫外分光光度法測定濃縮液中紫草總色素質量，將適量2%氫氧化鈉溶液加入濃縮液，使濃縮液由紫紅色變為藍色，濾過，得濾餅和濾液，滴加適量甲酸于濾液中，使濾液由藍色變為紅色，加入適量石油醚(沸程60～90 ℃)多次萃取至下層不顯紅色，取上層過濾，得濾液，回收石油醚，于45 ℃干燥，得左旋紫草素粉末狀結晶，稱重，并用高效液相色譜法測定左旋紫草素含量，計算轉化率。

2.2 紫草總色素質量測定 準確吸取提取濃縮液1.00 mL置100.00 mL量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，用95%乙醇作參比，用紫外分光光度計，選擇波長516 nm測定吸光度，按左旋紫草素(吸光系數E為242)計算紫草總色素的質量。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Discovery C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速1.0 mL·min-1；進樣量10 μL；檢測波長516 nm；流動相：甲醇-水-甲酸(85：15：0.1)；柱溫：室溫。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取左旋紫草素對照品12.50 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，得1.250 mg·mL-1對照品溶液，作為對照品儲備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取紫紅色粉末狀結晶20 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.3.4 標準曲線的制備 精密量取對照品儲備液適量，按倍比稀釋法制備5個濃度的對照品溶液，濃度分別為1.250，0.625，0.312，0.156，0.078 mg·mL-1，吸取上述溶液，進樣10 μL，以進樣濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。回歸方程為：Y=10 268X-111.15，r=0.999 49(n=5)，線性范圍0.078～1.250 mg·mL-1。

2.3.5 精密度試驗 精密取“標準曲線的制備”項下制備的濃度為0.156 mg·mL-1標準溶液，連續進樣5次，峰面積RSD為0.43%，表明精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 取左旋紫草素對照品溶液(濃度為1.25 mg·mL-1)在室溫下放置2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h，分別吸取10 μL，測定峰面積，RSD為0.929%，結果顯示在24 h內基本穩定。

2.3.7 重復性實驗 取同一樣品5份，按”2.3.3”項下方法制備，按上述色譜條件測定，以左旋紫草素含量計算，RSD為0.92%。

2.3.8 回收率實驗 取已知含量樣品一定量，加入適量對照品，按樣品溶液制備方法制備，測定含量并計算回收率，得平均回收率為99.8%，RSD為2.1%(n=6)。

2.4 正交實驗 通過單因素試驗，選擇對紫草總色素轉化為左旋紫草素工藝影響較大的3個主要因素，即轉化溫度(A)、轉化時間(B)、2%氫氧化鈉體積與紫草總色素的質量比(C)作為考察對象，選取L9(34)正交表進行實驗，以提取液中左旋紫草素的轉化率為考察指標。因素水平見表1，正交實驗安排及結果見表2，方差分析見表3，紫草總色素轉化前后HPLC譜見圖1。

表1 因素與水平表 Tab.1 Factors and levels

A：轉化溫度；B：轉化時間；C：2%氫氧化鈉體積與紫草總素的質量比

A：transformation temperature；B：transformation time；C：ratio of 2% NaoH to alkanna tinctoria pigment

表2 正交試驗結果 Tab.2 Design and results of orthogonal test

A：轉化溫度；B：轉化時間；C：2%氫氧化鈉體積與紫草總素的質量比

A：transformation temperature；B：transformation time；C：ratio of 2% NaoH to alkanna tinctoria pigment

表3 方差分析表 Tab.3 Analysis of variance

F1-0.05(2，2)=19.00 ；F1-0.01(2，2)=99.00

從轉化前后的液相色譜圖中可以看出，紫草總色素基本上轉化為左旋紫草素，并且含量>84%。正交實驗結果表明，因素A、B和C對紫草總色素轉化為左旋紫草素都有顯著的影響，3個因素對轉化率的影響大小依次為C>B>A。因此，紫草素總色素轉化為左旋紫草素的最佳工藝條件為：A2B2C3，即轉化溫度為35 ℃，轉化時間為4 h，2%氫氧化鈉與紫草總色素用料的比例為4.5 mL·mg-1。

2.5 驗證實驗 按照轉化溫度為35 ℃，轉化時間為4 h，2%氫氧化鈉與紫草總色素用料的比例為4.5 mL·mg-1進行3批小試驗證實驗，左旋紫草素的轉化率分別為63.34%，64.56%，66.68%，平均轉化率為64.86%。

A.轉化前；B.轉化后；1.左旋紫草素

Fig.1 HPLC chromatograms of Arnebia euchroma pigment before and after conversion

3 討論

在紫草藥材中，左旋紫草素具有強大的生物活性，目前在有關紫草素的制劑中也以左旋紫草素為主要檢測指標。現階段，關于紫草天然藥物化學成分的研究，大多局限于提取工藝方面，由紫草總色素轉化為左旋紫草素的研究報道較少。紫草中所含化學成分主要為紫草總色素，這類物質多數結合成酯的形式存在，通過

堿化可以去掉側鏈上的酯基，形成左旋紫草素。再根據結構中具有酚羥基，顯酸性，能溶于堿液，加酸酸化又可析出的性質，可得到高純度的左旋紫草素[7]。

在轉化過程中，主要考察了轉化溫度、轉化時間、2%氫氧化鈉溶液體積與紫草總色素的質量比。實驗過程中發現，過量的氫氧化鈉會使溶液的顏色變為綠色，紫草總色素溶液局部過度堿化，總色素的化學結構遭到破壞；而氫氧化鈉用量不足又會使溶液顯藍紫色，堿化不完全，降低左旋紫草素的轉化率。綜合考慮，選擇濃度為2%氫氧化鈉溶液，轉化時間4 h，2%氫氧化鈉的體積與紫草總色素的質量比例為4.5 mL·mg-1。實驗中，得藍色油狀濾餅，取該濾餅，加石油醚溶解，加入甲酸，生成紫紅色溶液，經高效液相檢測發現其中左旋紫草素含量達20%，而萘醌類左旋紫草素溶于堿性濾液，原因可能為紫草的醇提溶液中含有非酸性類脂溶性物質，形成類似于水包油體系，使得左旋紫草素包裹其中，造成損失；目前的研究基本都忽略了該濾餅成分，故回收該濾餅，再次應用最佳工藝，最大化利用原料，提高整體的轉化率。實驗過程中采用醇提石油醚萃取，適用于工業化生產，經濟環保，易于回收，對環境污染較小；選用高效液相色譜作為檢測方法，指標簡單、快速、準確；本研究的完成可促進紫草素提取物在制劑成型工藝方面的應用，有望將其制備成高效、低毒的現代劑型，使紫草素在治療疾病方面發揮更好的作用。

[1] 王威，鄒金華.天然紫草素的研究[J].食品科學，2002，23(6)：56-58.

[2] 喬秀文，蘭衛，李洪玲，等.新疆紫草中多糖的超聲提取工藝優選[J].中草藥，2004，35(8)：57-58.

[3] XIN C，LU Y，JOOST J，et al.Cellular harmacology studies of shikonin derivatives[J].Phytotherrec，2002，6(1)：199-209.

[4] 嚴松柏，談獻和，胡玉濤.紫草的研究進展[J].時珍國醫國藥，2003，14(2)：104-106.

[5] 雪梅，王桂玲，費洪榮，等.紫草有效成分的提取及其抗炎作用研究[J].中藥藥理與臨床，2008，24(4)：36-38.

[6] 秦愛萍，張傳印，陸麗.左旋紫草素抗炎作用的實驗研究[J].現代生物醫學進展，2009，9(18)：3432-3434..

[7] 董海榮，紫草素提取轉化精制工藝研究[D].天津：天津大學，2004：34-35.

Transforming Process of Shikonin

ZHOU Jian1, GUO Ruixia2, WANG Ruxing1, ZHAO Guiqin1

(1.InstituteofChineseMateriaMedica,ChengdeMedicalCollege,HebeiKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentforTraditionalChineseMedicine,Chengde067000,China； 2.SchoolofChemicalEngineering,ShijiazhuangUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To investigate the optimal condition for transforming alkanna tinctoria pigment into shikonin. Methods Transformation rate of shikonin served as index.Transformation temperature, time, ratio of 2% NaOH to alkanna tinctoria pigment (v/w) was optimized. Results With ratio of 2% NaOH to alkanna tinctoria pigment being 4.5 mL·mg-1, temperature 35 ℃ and the reaction time 4 h, the transformation rate reached the highest, and the average transformation rate was 64.86%. Conclusion This method is easy and simple, and suitable for industrialized production.

Alkanna tinctoria pigment； Shikonin； Orthogonal design

2014-11-05

2015-02-06

*河北省高等學校科學研究計劃(Q2012096)；河北省研究生創新資助項目(Z0000004)

周健(1991-)，男，湖南婁底人，在讀碩士，主要從事中藥新劑型研究。電話：(0)18703349024，E-mail：380795835@QQ.com。

王汝興(1973-)，男，河北承德人，副教授，在讀博士，主要從事中藥新劑型研究。電話：(0)13653248958，E-mail：Wangru1973@sina.com。

R286；TQ460.6

B

1004-0781(2015)12-1637-03

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.022