丁苯酞氯化鈉注射液對急性缺血性腦卒中患者內皮祖細胞的影響

胡杰杰，薛茜，鄒玉安

(1.河北北方學院，張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫院神經內科，張家口 075000)

丁苯酞氯化鈉注射液對急性缺血性腦卒中患者內皮祖細胞的影響

胡杰杰1，薛茜2，鄒玉安2

(1.河北北方學院，張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫院神經內科，張家口 075000)

目的觀察丁苯酞氯化鈉注射液對急性缺血性腦卒中(AIS)患者外周循環內皮祖細胞(EPCs)水平的影響，通過分析EPCs水平與血漿基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α)濃度的相關性，探討丁苯酞氯化鈉注射液可能的作用機制。方法選取AIS患者59例，隨機分為治療組與對照組，丁苯酞氯化鈉注射液治療14 d為1個療程。入院后第1，8，15天清晨抽取患者肘靜脈血，流式細胞儀檢測外周血EPCs含量，CD34+CDl33+KDR(CD309)+確認為內皮祖細胞，酶聯免疫吸附測定法檢測患者血漿SDF-1α濃度，同時于上述時間點對患者進行美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分。結果治療組患者與對照組患者外周血EPCs水平14 d內均逐漸升高，EPCs水平基線期兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，治療組第8，15天EPCs水平與同期對照組比較，均差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。SDF-1α濃度變化與EPCs水平變化相似。兩組患者NIHSS評分14 d內均逐漸降低，基線期NIHSS評分兩組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，治療組第8，15天NIHSS評分均較同時間點對照組明顯降低(P<0.05或P<0.01)。Pearson相關分析顯示治療組第8，15天血漿SDF-1α濃度與外周血EPCs水平高度相關(r=0.747，P<0.01；r=0.811，P<0.01)。兩組患者用藥期間均無不良事件發生。結論丁苯酞氯化鈉注射液可以有效改善AIS患者急性期內神經功能缺損，其機制可能為通過上調SDF-1α的表達，促進EPCs動員，改善缺血部位血液循環。

丁苯酞氯化鈉注射液；腦卒中，缺血性，急性；內皮祖細胞；基質細胞衍生因子-1α

丁苯酞氯化鈉注射液是我國研發的國家一類新藥，它通過保護線粒體功能、清除氧自由基、抑制血小板聚集、改善缺血部位血液循環等作用，顯示出良好的抗腦缺血能力。以往研究顯示丁苯酞能夠安全有效提高急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)患者美國國立衛生研究院卒中量表(national institute of health stroke scale，NIHSS)評分，改善患者神經功能缺損[1-2]。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內皮的前體細胞，具有分化為成熟內皮細胞促進血管內皮修復的能力。腦梗死動物模型已證實，骨髓來源的EPCs參與了梗死部位周邊新血管的形成[3]。基質細胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor-1α，SDF-1α)通過SDF-1/C-X-C家族趨化因子受體-4(C-X-C chemokine receptor- 4，CXCR-4)軸的作用在EPCs動員過程中發揮重要作用[4]。研究表明，外周血EPCs水平在缺血性卒中后7 d內逐漸增加，血漿SDF-1α濃度在卒中后7 d也是增加的，二者正相關[5]。目前有關丁苯酞氯化鈉注射液改善缺血腦組織血液循環機制的報道較少，本研究以AIS患者急性期丁苯酞氯化鈉注射液治療為立足點，從卒中后早期血管生成、恢復血流灌注的角度出發，通過測定AIS患者急性期不同時間點外周血EPCs水平及血漿SDF-1α濃度，分析兩者相關性，旨在闡明丁苯酞氯化鈉注射液在AIS治療中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 AIS診斷標準：安靜狀態下或活動中發病；大多數發病時無明顯頭痛和嘔吐；有頸內動脈系統癥狀和體征；頭顱磁共振檢查(彌散加權成像)顯示與癥狀和體征相匹配的新發梗死病灶。入選標準：缺血性腦卒中患者為首次發生的頸內動脈系統的非腔隙性腦卒中，在癥狀出現72 h內入組，均為頭顱磁共振檢查所證實，NIHSS評分≥5分。腦卒中的診斷標準均符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的缺血性腦卒中診斷標準[6]。排除標準：顱內出血性疾病；急性炎癥性疾病；嚴重的肝腎疾病；血液性疾病；慢性消耗性疾病或惡性腫瘤；精神疾病；重度意識障礙或既往腦卒中病史；6個月內有丁苯酞軟膠囊或丁苯酞氯化鈉注射液使用史；6個月內有心肌梗死或其他動脈梗死病史；6個月內有外傷、手術史；6個月內有他汀類、氯吡格雷、促紅細胞生成素等藥物服用史；對芹菜過敏。嚴格參照上述標準選取2013年6月—2014年6月入河北北方學院附屬第一醫院神經內科治療的AIS患者63例，其中男33例，女30例，按入院先后順序編碼，奇數號患者入選治療組，偶數號患者入選對照組，其中對照組患者因發現惡性腫瘤剔除1例，并發急性膽囊炎(丁苯酞氯化鈉注射液治療尚未開始)剔除1例，未完成血樣采集脫落1例，治療組未完成血樣采集脫落1例。最終進入該研究對照組的患者為29例，男19例，女10例，治療組患者30例，男21例，女9例。兩組患者年齡、性別、血壓、血脂、血糖等一般臨床資料相匹配，差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1。該研究通過河北北方學院附屬第一醫院倫理委員會審查，所有受試者入組前均簽署自愿參加該項研究的知情同意書。

1.2 治療方法 治療組給予丁苯酞氯化鈉注射液(石藥集團恩必普藥業有限公司，批準文號：國藥準字H20100041，規格：100 mL：丁苯酞25 mg與氯化鈉0.9 g) 25 mg·(100 mL)-1靜脈滴注，bid。對照組給予氯化鈉注射液(石藥集團恩必普藥業有限公司，規格：100 mL，外觀包裝、批號與丁苯酞氯化鈉注射液完全一致)100 mL靜脈滴注，bid，療程均為14 d。丁苯酞氯化鈉注射液及氯化鈉注射液的治療均在入院后第1天留取靜脈血和完成NIHSS評分后開始進行。除此，兩組均使用相同的基礎用藥，主要為：阿司匹林腸溶片(拜耳醫藥保健有限公司，批準文號：國藥準字J20130078，規格：100 mg)100 mg，po，qd，普伐他汀鈉片(華北制藥股份有限公司，規格：10 mg，批準文號：國藥準字H20050736)20 mg，po，qn，依達拉奉注射液(吉林省輝南長龍生化藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字H20080592，規格：20 mL：30 mg)30 mg，靜脈滴注，bid。兩組患者的治療均按照《中國急性缺血性腦卒中診治指南》進行。

1.3 觀察指標 兩組患者入院后第1，8，15天清晨空腹抽取患者肘部外周靜脈血用于外周血EPCs檢測和血漿SDF-1α濃度檢測[人SDF-1α 酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒，R&D公司進口分裝，規格：96T，批號：20131122]，并由經過專業培訓的神經病學醫師在上述相應時間點對入選患者進行NIHSS評分。EPCs檢測：新鮮靜脈血2 mL中按1：1加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)2 mL，充分混勻，后以1：1比例緩慢加于人淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限公司，規格：200 mL，批號：20130220-1199)4 mL之液面上，保持與分離液界面清晰，400×g，離心25 min，小心留取中間環形絮狀單個核細胞層，PBS洗滌兩次后，留取單個核細胞，取分離洗滌好的單個核細胞懸液100 μL，加入熒光標記的Anti-CD34/FITC(北京博奧森生物技術有限公司，規格：100 μg，批號：980782)、Anti-CD133/APC(北京博奧森生物技術有限公司，規格：100 μg，批號：20131113)、Anti-KDR(CD309)/PE(BD公司，規格：100T，批號：3109796)各10 μL，震蕩混勻，室溫避光孵育10 min，PBS洗滌兩次，流式細胞儀(BD公司)檢測500 000個細胞，3種抗體均為陽性的細胞確認為EPCs，其細胞數作為外周血中EPCs水平；同型抗體做陰性對照。見圖1。SDF-1α檢測：2 mL新鮮靜脈血，3 000 r·min-1(r=8 cm)離心20 min，收集上清用于SDF-1α濃度檢測；血漿SDF-1α濃度使用ELISA試劑盒進行檢測，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 兩組患者NIHSS評分 兩組基線期(第1天)NIHSS評分差異無統計學意義；第15天，對照組NIHSS評分顯著低于基線期(P<0.01)；治療組NIHSS評分第8，15天均較基線期明顯降低，而第15天較第8天又有下降；與對照組比較，治療組第8，15天NIHSS評分均明顯降低。見表2。

2.2 兩組患者外周血EPCs水平 基線期外周血EPCs水平差異無統計學意義，隨后14 d內均逐漸升高。兩組組內各時間點方差分析均顯示存在統計學差異。治療組第8，15天EPCs水平較對照組均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。見表2。

A、B、C：第1天；D、E、F：第8天；G、H、I：第15天；CD309：KDR

2.3 兩組患者血漿SDF-1α濃度變化 與EPCs相似，14 d內均逐漸升高。兩組組內各時間點方差分析均顯示存在差異統計學意義。治療組第8，15天血漿SDF-1α濃度較對照組均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。見表2。

2.4 相關性分析 對照組第15天血漿SDF-1α濃度與同時間點EPCs水平顯著正相關，差異有統計學意義(r=0.518，P<0.01)；治療組第8，15天，血漿SDF-1α濃度與同時間點EPCs水平高度正相關，差異有統計學意義(分別為r=0.747，P<0.01；r=0.811，P<0.01)。

表1 兩組患者一般情況比較

組別例數發病時間/h性別男/例女/例年齡/歲高血壓例%糖尿病例%吸煙例%飲酒例%對照組2928．00±21．19191064．07±12．341344．831034．48724．14517．24治療組3030．03±22．3621961．60±10．131550．001550．001446．67930．00組別高低密度脂蛋白血癥例%高同型半胱氨酸血癥例%糖化血紅蛋白?1/%治療前空腹血糖?1治療后空腹血糖?1(mmol·L-1)對照組1344．831241．388．78±2．018．09±2．076．20±0．84治療組1860．00930．008．31±1．608．28±2．416．06±0．95

*1：糖尿病患者

表2 兩組患者NIHSS評分及EPCs水平和SDF-1α濃度的比較

組別與時間例數NHISS評分/分EPCs(個/100萬個細胞)SDF?1α/(ng·L-1)對照組29 第1天10．07±2．9460．55±20．67879．55±427．23 第8天9．52±2．6873．90±22．64?11094．36±490．08?1 第15天8．00±3．05?1?290．14±26．71?1?21306．71±391．27?1?2治療組30 第1天10．67±2．1961．50±20．73956．86±438．37 第8天8．23±1．92?1?388．90±27．65?1?31407．30±560．99?1?3 第15天6．03±1．75?1?2?5115．37±29．69?1?2?41687．05±585．01?1?2?5

組內比較(重復測量資料的方差分析)，F=25.85，190.57，37.03，58.82，30.61，27.2，均為P<0.01，與基線期第1天相較，*1P<0.01，與第8天相較，*2P<0.01；與對照組相同時間點比較，t=2.12，2.28，2.28，*3P<0.05，t=3.43，*4P<0.01(兩獨立樣本t檢驗)，z=2.68，2.74，*5P<0.01(兩獨立樣本秩和檢驗)

2.5 不良反應 兩組患者用藥期間均未出現肝腎功能等指標異常，無再次卒中等不良事件發生。

3 討論

丁苯酞是由芹菜中提取的消旋-3-正丁基苯酞，通過多靶點作用表現出良好的抗缺血能力[7]。動物實驗顯示丁苯酞可以增加梗死區域血流量，口服丁苯酞軟膠囊的療效也在臨床研究中得以驗證[1]。急性期是AIS治療的關鍵時期，口服丁苯酞軟膠囊生物利用率低，而且膠囊制劑亦不適用于存在吞咽困難的患者，故本研究以丁苯酞氯化鈉注射液為治療干預措施，探討其改善缺血腦組織血運的機制。研究中通過對兩組患者NIHSS評分進行比較，證實丁苯酞氯化鈉注射液可以顯著改善急性缺血性卒中患者神經功能缺損，與已有臨床研究結果相符[2]。

外周血EPCs，是血管系統的重要組成成分，可分化為成熟的內皮細胞，參與血管受損后修復和血管生成。腦內內皮細胞再生極其有限，而EPCs以其修復受損血管的獨特優勢，在腦梗死后改善缺血組織血液循環中發揮重要作用。動物實驗和臨床研究均已顯示EPCs參與了腦缺血組織新血管形成過程[3-8]。EPCs可以通過它的血管生成能力重塑卒中后受損的血腦屏障，促進腦卒中恢復，并消除大腦和血管的免疫反應[9]。

研究顯示，CD34+的EPCs在卒中后7 d內逐漸增加，并保持明顯高于卒中前基線水平至第14天，30天回歸到基線水平。在本研究中兩組患者急性期內EPCs水平均逐漸升高，這與文獻[8]結果相吻合。EPCs水平升高更顯著的治療組第15天NIHSS評分也較低，推測EPCs通過參與腦卒中缺血部位血管生成，促進了患者神經功能恢復。SOBRINO等[8]指出，AIS患者外周循環中EPCs的數量反應性增加，而且增加的程度與較好的功能預后直接相關，YIP等[10]研究顯示循環中EPCs的水平能夠獨立的預測缺血性腦卒中患者的預后，而且缺血性卒中急性期患者循環中EPCs水平的增加是卒中后90 d較好臨床預后唯一的獨立預測因素。遺憾的是本研究由于實際情況限制，未能完成90 d隨訪，但治療組急性期EPCs水平較對照組顯著升高，根據YIP等[10]的研究推測，丁苯酞氯化鈉注射液治療組患者卒中90 d的神經功能恢復也應較好。

本研究中，根據患者外周血EPCs數量與血漿SDF-1α濃度的相關分析結果推斷丁苯酞氯化鈉注射液上調了患者SDF-1α的表達，在SDF-1/CXCR-4軸的作用下，EPCs由骨髓向外周循環的動員增加。大多數EPCs靜態存在于骨髓微環境中，一些信號可以將其從骨髓中動員出來。SDF-1α是EPCs重要的動員因子，它由骨髓基質細胞表達，是帶有CXCR-4特異性受體的CXC家族趨化因子，也是一種強效的造血干細胞化學吸引分子。在動員過程中，SDF-1α與表達于EPCs表面的CXCR-4結合，介導EPCs向缺血部位和動脈損傷部位募集。有報道指出SDF-1α與缺血性卒中患者早期外周循環中EPCs的增加相關[11]。在YU等[12]的研究中將SDF-1α注射到缺血部位，觀察到EPCs的募集。

總之，根據本研究結果推斷丁苯酞氯化鈉注射液可通過提高外周血EPCs水平，改善缺血部位血液循環，促進AIS患者急性期內神經功能改善，其動員機制可能為上調SDF-1α的表達。

本研究由于條件限制，未能對入選者進行追蹤隨訪，對丁苯酞氯化鈉注射液遠期影響未能進行觀察。此外，本研究納入病例數較少，兩組入選患者同時使用依達拉奉和他汀類藥物，均可能會對結果產生一定影響。

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2016年《醫藥導報》各期藥物專欄要目

第1期：中藥與天然藥物專欄； 第7期：感染科用藥專欄；

第2期：風濕免疫疾病用藥專欄； 第8期：腫瘤科用藥專欄；

第3期：呼吸科用藥專欄； 第9期：神經內科用藥專欄；

第4期：麻醉科用藥專欄； 第10期：精神心理疾病用藥專欄；

第5期：兒科用藥專欄； 第11期：消化內科用藥專欄；

第6期：婦產科計劃生育用藥專欄； 第12期：皮膚性病用藥專欄。

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《醫藥導報》編輯部

2014-11-24

2015-04-20

胡杰杰(1981-)，女，河北衡水人，主治醫師，碩士，研究方向：腦血管病。電話：(0)15379043317，E-mail：2590260537@qq.com。

鄒玉安(1957-)，男，河北張家口人，主任醫師，碩士，研究方向：腦血管病。電話：(0)13383130012，E-mail：zya8857111@sohu.com。

R973.2；R743.3

B

1004-0781(2015)12-1609-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.016