外源亞精胺對黃果柑果實抗氧化酶活性的影響

熊 博，汪志輝，高婧斐，張婷婷，石冬冬，古咸杰，曾海瓊，廖 玲

(四川農業大學園藝學院,四川 成都 611130)

外源亞精胺對黃果柑果實抗氧化酶活性的影響

熊 博，汪志輝*，高婧斐，張婷婷，石冬冬，古咸杰，曾海瓊，廖 玲

(四川農業大學園藝學院,四川 成都 611130)

為探索亞精胺（spermidine，Spd）與3 種抗氧化酶過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性變化的關系，以及黃果柑果實成熟過程中抗氧化酶活性的變化趨勢。以5 a生黃果柑果樹為實驗材料，設置3 個不同質量濃度的亞精胺處理，通過葉面、果面噴施亞精胺，研究外源亞精胺對黃果柑果實發育后期抗氧化酶活性的影響。結果表明:外源Spd能顯著提高黃果柑果實中Spd和精胺含量，極顯著降低腐胺含量；顯著提高黃果柑果實轉色初期CAT、POD和SOD活性；顯著降低成熟后果實丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，推遲MDA含量快速累積的時間。結果顯示，外源Spd具有改善黃果柑果實抗氧化保護系統的功能，通過調控黃果柑果實抗氧化酶活性，提高自由基防御系統的防御能力。

亞精胺；黃果柑；抗氧化酶；丙二醛

多胺是一類具有較高生物活性的低分子脂肪族含氮堿胺[1]，是廣泛存在于植物、動物和微生物體內的多聚陽離子，易與細胞中帶有負電荷的物質結合，保持膜結構的穩定，直接或間接清除體內活性氧自由基[2-3]，防止細胞膜脂過氧化，延遲衰老，甚至與植物的生存密切相關[4-5]。在植物細胞中，精胺（spermine，Spm）、亞精胺（spermidine，Spd）以及其合成前體腐胺（putrescine，Put）是3 種最常見的多胺[6-7]。

大量研究表明，外源多胺能提高植物的抗逆能力[4,8-9]，外源Spd和Spm對環境脅迫下的植物具有保護作用[10-11]，Spd與植物逆境脅迫抗性的關系最為密切[8]。外源Spd能降低NaCl脅迫下黃瓜幼苗的活性氧水平、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和H2O2含量[12]，增強超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性，從而緩解NaCl對植株的傷害[13-15]；外源Spd有助于提高植物對多種脅迫的耐受力[16]，在非生物脅迫條件下，Spd可能是通過向非原生質體中運輸，并在多胺氧化酶催化下氧化降解形成H2O2，繼而H2O2發揮的信號特征決定植物的逆境耐性[17]。目前，關于多胺與植物抗逆性關系的研究主要集中在草本和藤本植物上[18-20]。同時，外源Spd對果實成熟過程中抗氧化酶活性調控作用的報道較少。

黃果柑是蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus L.）雜柑品種，為橘和橙的天然雜交種[21]，原產于四川省雅安市石棉縣，是地方特色水果[22]。研究外源Spd對黃果柑成熟后期的抗氧化酶活性的調控機理，對黃果柑產業的健康發展都具有重要意義。本實驗通過研究不同質量濃度Spd對黃果柑果實發育中后期果實抗氧化酶活性的影響，探究黃果柑果實多胺含量和3 種抗氧化保護酶活性變化規律，為提高黃果柑的高效栽培管理和延長黃果柑的留樹時間提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

田間實驗于2013年5月—2014年4月在四川省雅安市石棉縣小水敬老院黃果柑果園內進行。選擇樹勢基本一致、健壯的黃果柑果樹（樹高、冠徑、坐果率基本一致，5 a生、生長狀況良好、無病蟲害、株行距3 m×4 m）36 株作為實驗樹，果園采用常規管理。

Spd 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1260型高壓液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2.1 外源Spd噴灑與采果方法

于2013年8月17日（果實快速膨大期）17時用小型噴霧器對黃果柑葉面、果面噴灑質量濃度分別為0.4、0.5、0.6 g/L的Spd，至果面和葉面自然滴液為止，以清水處理為對照，15 d后重復處理1 次。以3 株黃果柑果樹為1 個處理，3 次重復，共設3 個處理和1 個對照。

從果實開始轉色（11月下旬）到果實成熟（3月下旬）前，每隔30 d左右采果1 次，采果時間分別是:2013年11月22日、2013年12月23日、2014年1月21日、2014年2月26日和2014年3月23日，果實成熟后每10 d進行1 次采果，采果時間分別是:2014年4月4日和2014年4月14日。每次采果時間為上午9時，隨機選擇大小適中、均勻一致、無病蟲、無損傷的果實，每個處理采果15 個。采果后將果實置于冰盒中，立即帶回實驗室于液氮中速凍固定，放入冰箱（-20 ℃）待用。

1.2.2 分析方法

MDA含量、POD和SOD活力的測定參照李合生等[23]的方法，CAT活性的測定參照鄒琦等[24]的方法。

多胺含量的測定:在馬寶龍等[25]測定方法的基礎上加以改進，用1260型高壓液相色譜儀檢測，流動相為64%的甲醇（色譜純）和36%的水，反相C18柱（3.9 mm×150 mm），檢測波長256 nm，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。

1.3 數據分析

苦瓜 性平、味甘，具有解毒排毒、養顏美容等功效?？喙现泻幸环N具有明顯抗癌作用的活性蛋白質。這種蛋白質能激發人體內免疫系統的防御功能，增加免疫細胞的活性，清除體內的有害物質。

采用Excel 2010和SPSS 20對數據進行Duncan’s新復極差法多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 外源Spd對黃果柑果實中多胺含量的影響

表1 轉色期和成熟期黃果柑果實中多胺含量Table1 PA contents during the early color-turning period and maturation period of Huangguogan fruits

通過檢測黃果柑轉色初期和果實成熟期果實多胺含量，如表1所示，外源Spd處理極顯著增加了轉色初期、成熟期黃果柑果實中Spd的含量，極顯著降低了Put的含量；在黃果柑果實轉色初期，未能檢測出Spm含量，果實成熟期Spd處理組樣品中Spm含量分別為1.30、1.56、1.52 mg/g，而對照組果實Spm含量為0；果實成熟期與轉色初期相比，Put含量有所降低，而Spd和Spm含量有較大幅度的增加；轉色初期4組樣品中Spd、Spm含量之和與Put含量的比值，即（Spd+Spm）/Put分別為0.31、0.33、0.30和0.24，而果實成熟后4 組樣品中（Spd+ Spm）/Put分別為0.83、1.02、0.91和0.60，均以0.5 g/L處理組的值最大；果實成熟后Spd含量分別是轉色初期含量的2.03、2.30、2.27、2.39 倍。

2.2 外源Spd對黃果柑果實MDA含量的影響

圖1 外源Spd對黃果柑果實MDA含量的影響Fig.1 Effects of exogenous Spd on MDA content of ‘Huangguogan’ fruits

MDA含量的變化是質膜損傷程度的重要標志之一，其含量的多少可代表膜損傷的嚴重程度。由圖1可知，黃果柑果實內MDA含量呈現緩慢增長到快速增長的變化規律，外源Spd能顯著降低黃果柑成熟后期果實MDA含量。當果實成熟時，外源Spd處理的黃果柑果實MDA含量比對照組平均降低了44.47%。果實成熟后，對照組黃果柑果實MDA含量出現快速增長的現象，且增長速度大于同時期外源Spd處理組，而外源Spd處理組的黃果柑果實MDA含量直到果實成熟后10 d（2014年4月4日）才出現快速增長現象，較對照組延后了10 d左右，說明外源Spd處理推遲了黃果柑果實MDA快速增長的時期。

2.3 外源Spd對黃果柑果實CAT活性的影響

圖2 外源Spd對黃果柑果實CAT活性的影響Fig.2 Effects of exogenous Spd on CAT activity of ‘Huangguogan’ fruits

果實成熟后期，由于體內活性氧代謝加強而使H2O2產生積累。CAT可將H2O2分解為H2O和O2，使生物機體免受過氧化氫的毒害，是植物體內重要的抗氧化酶之一。由圖2可知，從轉色初期到果實成熟的過程中，黃果柑果實CAT活性呈現“降-升-降”的變化規律；黃果柑果實轉色初期，CAT活性緩慢降低；果實成熟后，CAT活力出現一個峰值，之后迅速降低；果實成熟后10 d（2014年4月4日）所有處理組CAT活力的峰值均顯著高于對照組，0.5 g/L Spd處理組的黃果柑果實CAT活力的峰值最高，為6.12 U/g；與對照組相比，外源Spd處理的黃果柑果實CAT活性出現峰值的時間推遲了10 d。

2.4 外源Spd對黃果柑果實SOD活性的影響

圖3 外源Spd對黃果柑果實SOD活性的影響Fig.3 Effects of exogenous spermidine on SOD activity of ‘Huangguogan’ fruits

SOD與CAT、POD等協同作用防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜的傷害，其酶活力與抗逆性及衰老有密切關系，是活性氧清除體系中的關鍵酶。由圖3可知，轉色初期處理組果實SOD活性較高，活性大小變化較為明顯，這可能與葉面、果面噴施外源Spd溶液有關；從轉色初期到果實成熟的過程中，處理組和對照組黃果柑果實SOD活力總體都呈現“降-升-降”的變化趨勢，但對照組果實SOD活力在成熟期之前變化較小，果實成熟后到達最大值，為106.16 U/g；處理組黃果柑果實SOD活力于果實成熟后10 d才出現峰值，0.5 g/L Spd處理組黃果柑果實SOD活力值最大，為121.46 U/g，顯著高于對照組。

2.5 外源Spd對黃果柑果實POD活性的影響

圖4 外源Spd對黃果柑果實POD活性的影響Fig.4 Effects of exogenous spermidine on POD activity of ‘Huangguogan’ fruits

POD是植物體內一種消除自由基傷害防護酶，在活性氧代謝過程中發揮了重要的作用。由圖4可知，黃果柑果實POD活性呈現類似“V”字型變化趨勢，緩慢降低后再迅速增大。在果實成熟前，處理組和對照組黃果柑果實POD活力相對較低，果實成熟后對照組POD活力急劇升高，且顯著高于Spd處理組；黃果柑果實成熟前，0.5 g/L Spd處理組果實POD活性顯著高于對照，而成熟后則顯著低于對照；果實成熟時（2014年3月23日），對照組黃果柑果實POD活力為2.94 U/g，顯著高于同期處理組，0.4 g/L Spd處理組的酶活力最低。說明外源Spd處理能有效調控黃果柑果實POD活力，使之在整個黃果柑果實發育后期維持在較為穩定的酶活力水平。

3 討 論

外源Spd處理可不同程度提高植物體活性氧清除能力，降低活性氧對植物體的氧化傷害[20,26-27]。本實驗結果表明:外源Spd具有改善黃果柑果實抗氧化保護系統的功能，通過調控黃果柑果實SOD、POD和CAT 3 種抗氧化保護酶活性，增強活性氧的有效清除能力，進而減少活性氧產生，提高了清除自由基防御系統的防御能力，緩解了果實O2-·、H2O2的積累，降低了黃果柑果實的MDA含量。

在植物抗逆性中，Spd既是脅迫保護物質，也是脅迫信號轉導過程中的信號分子，有利于脅迫抗性機制的構建[28-29]。本結果表明，外源Spd處理后，黃果柑果實Spd和Spm含量顯著上升，而Put含量極顯著降低。Put作為Spd和Spm合成的前體物質，果實成熟后逐漸合成Spd和Spm，導致果實Put含量進一步降低，而Spd和Spm含量增長幅度較大。同時，抗氧化酶活性也相應提高，表明黃果柑果實多胺含量與抗氧化酶活性可能存在著某種聯系。結果表明，在外源Spd處理之下，黃果柑果實中（Spd+Spm）/Put的比值與SOD和CAT活力間相關系數R值分別為0.932 2和0.906 1，該比值與SOD和CAT活力呈正相關性。說明外源Spd與黃果柑果實活性氧代謝密切相關，Spd處理增強了抗氧化酶活性，降低果實MDA對黃果柑的傷害，這與江行玉[30]、薩日娜[31]、劉俊[32]等的研究結果一致。外源Spd處理對黃果柑果實3 種抗氧化酶活力有一定的調控作用，增大了3 種抗氧化酶活性的變化幅度，但其變化規律與對照基本一致。果實成熟前3 種抗氧化酶活性均出現減弱的現象，這種變化規律的形成原因還有待進一步的研究。

Spd還是H+的載體，它可以部分代替SOD的作用，通過歧化反應來有效清除活性氧[33]，Spd在黃果柑果實成熟后期活性氧清除的過程中，主要是直接清除活性氧，還是作為酶保護劑間接清除，需要進一步的研究驗證。

CAT和SOD是抗氧化過程中的直接作用酶，活力越強抗氧化能力越強，而POD是被動清除酶，果實成熟后POD活力、MDA含量均低于對照，反映出Spd處理組黃果柑果實完整性較好，間接說明Spd處理增強了果實的抗氧化能力。

POD活力大小是果實成熟衰老的主要標志，可作為組織老化的一種生理指標[34]。李夢釵等[35]研究也表明，在植物生長發育過程中，POD的活性不斷發生變化，一般在老化、衰老組織中其活性較高，在幼嫩組織中活性較弱。本研究結果表明，隨著黃果柑果實的成熟，MDA含量和POD活性都有一定程度的增大，說明在此過程中果實可能出現了衰老現象。

適量的外源Spd能有效增強黃果柑果實成熟前CAT、POD和SOD抗氧化酶的活性。同時，外源Spd降低果實成熟過程中MDA含量，表明Spd處理增強了果實的抗氧化能力，以0.5 g/L Spd質量濃度的綜合作用效果最好。

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Effects of Exogenous Spermidine on Activities of Antioxidant Enzymes in ‘Huangguogan’ Orange Fruits

XIONG Bo, WANG Zhihui*, GAO Jingfei, ZHANG Tingting, SHI Dongdong, GU Xianjie, ZENG Haiqiong, LIAO Ling
(College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

This study was conceived to explore the relationship between exogenous spermidine (Spd) and the activities of antioxidant enzymes, namely catalase (CAT), peroxidases (POD) and superoxide dismutase (SOD) and investigate the changes in these antioxidant enzyme activities during the ripening process of oranges. The leaves and fruits of fi ve-yearold ‘Huangguogan’ orange trees were sprayed with spermidine at three concentrations to examine the effect of exogenous Spd on the antioxidant enzyme activities during the later developmental stage. The results showed that exogenous Spd could signifi cantly improve the contents of Spd and spermine (Spm) and signifi cantly decrease the content of Put. During the early color-turning period, exogenous Spd treatment caused signifi cant increases in the activities of CAT, POD and SOD and a significant decrease in malondialdehyde (MDA) content in the ripe fruits, and retarded the rapid accumulation of MDA. These fi ndings suggest that exogenous Spd can improve the antioxidant defense system in ‘Huangguogan’ fruits by enhancing the activities of CAT, POD and SOD.

Spd; ‘Huangguogan’ orange; antioxidant enzymes; malondialdehyde

S666.9

A

10.7506/spkx1002-6630-201510048

2014-07-01

四川省科技支撐計劃項目(2011NZ0034)；四川省科技廳基金項目(10ZC1454)；四川農業大學研究生社會實踐與科技服務團項目(ACT201304)

熊博(1988—),男,博士研究生,研究方向為果樹栽培理論與技術。E-mail：xiongbo200977@163.com

*通信作者：汪志輝(1968—),男,教授,博士,研究方向為果樹栽培理論與技術。E-mail：wangzhihui318@126.com