肉雞屠宰加工中減菌處理前后細菌菌相分析

夏小龍，彭 珍，劉書亮,2,*，韓新鋒,2，周 康,2，鄒立扣，賴海梅

(1.四川農業大學食品學院,四川 雅安 625014；2.四川省農產品加工及貯藏工程重點實驗室,四川 雅安 625014；3.四川農業大學都江堰校區微生物學實驗室,四川 都江堰 611830)

肉雞屠宰加工中減菌處理前后細菌菌相分析

夏小龍1，彭 珍1，劉書亮1,2,*，韓新鋒1,2，周 康1,2，鄒立扣3，賴海梅1

(1.四川農業大學食品學院,四川 雅安 625014；2.四川省農產品加工及貯藏工程重點實驗室,四川 雅安 625014；3.四川農業大學都江堰校區微生物學實驗室,四川 都江堰 611830)

基于16S rDNA V6～V8可變區的聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術分析肉雞屠宰加工過程中減菌處理前后胴體或產品細菌多樣性。在預冷環節前采用50 ℃、1.5%乳酸溶液對肉雞胴體沖淋15 s進行減菌處理，采集屠宰加工環節中減菌處理前后的胴體或分割產品表面樣品，提取樣品中的細菌總DNA，通過16S rDNA V6～V8可變區的PCR擴增，變性梯度凝膠電泳，對PCR擴增 片段割膠回收、克隆測序分析減菌前后細菌菌相變化。結果表明，減菌前，胴體清洗環節DGGE條帶的數量最多、亮度最 強，細菌污染最嚴重，其次是分割 環節，而預冷環節細菌種類及數量最少，污 染程度最低；減菌后，各屠宰加工環節細菌種類與數 量較減菌前均有所減少，其中胴體清洗環節與分割環節細菌的種類與數量減少量最多，預冷環節細菌的種類及數量最少，不同屠宰加工環節細菌種類并不完全一致；乳桿菌屬細菌在整個肉雞屠宰加工過程中均有出現，與腸桿菌科和假單胞菌屬細菌為肉雞屠宰加工過程中的優勢腐敗菌。

聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳；肉雞；屠宰；減菌；細菌菌相

雞肉是世界上消費量增長速度最快，物美價廉的優質肉類，其安全性愈發受到人們關注。健康雞肉組織內部是沒有腐敗微生物與病原微生物污染的，然而肉雞在商業屠宰過程中，其皮膚、羽毛、消化道等均攜帶大量的天然菌群，肉雞胴體及其分割產品表面微生物的污染是不可避免的[1-2]。但在某些加工環節，如浸燙脫毛、預冷等環節，又能夠 有效減少微生物的數量[3]，而有些操作點也會成為交叉污染點。

目前，肉雞生產過程中微生物污染很多基于傳統培養法研究微生物數量以確定污染源[4-5]。Ampe等[6]證 明至少25%～50%的微生物菌群不能有效地在外界培養，導致不能全面反映微生物分布的真正情況[7-8]。變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）可避免傳統微生物技術的缺陷，能更全面地認識微生物分布，更加有效地分析微生物污染源[9-10]。本研究在彭珍等[11]對肉雞屠宰加工過程中肉雞胴體與產品的微生物污染分析及減菌研究基礎上，通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE技術研究在肉雞商業屠宰加工過程中，預冷環節前使用乳酸結合熱水進行減菌處理，分析減菌前后細菌菌相變化情況，旨在探究肉雞商業屠宰過程中細菌的分布、變化和減菌效果，為實際生產中的微生物污染控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川某肉雞屠宰加工廠生產鏈上(脫毛、掏膛、胴體清洗、預冷)的肉雞胴體以及分割、速凍后的肉雞產品。

TIANDZ柱式細菌DNAOUT 成都康迪生物技術有限公司；Premix Taq、Gold View核酸染料、DNA Marker DL2000、Agarose Gel DNA Purifcation Kit Ver.2.0、X-Gal、IPTG、Amp、pMD19-T載體 寶生物工程(大連)有限公司；0.1 mol/L磷酸鹽(pH 7.0)緩沖液、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、去離子甲酰胺、尿素、Tris、過硫酸胺、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、50×TAE緩沖液、6%丙烯酰胺變性膠、固定液、染色液、顯色液。

1.2 儀器與設備

DTSK-2401 220變性梯度凝膠電泳、PTC-200 PCR儀（My CyclerTMThermal Cycler）、Gel Doc XR凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；B4i-BR4i冷凍離心機 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 肉雞胴體及產品表面取樣

于肉雞屠宰加工廠用棉拭子擦拭法分別取脫毛、掏膛、胴體清洗、預冷的肉雞胴體表面、分割以及速凍環節的肉雞產品表面污染樣品。每支滅菌棉拭子涂2 個點，每點涂5 cm2，一個樣用5 支滅菌棉拭子涂擦，共涂擦50 cm2（頭肛部各5 cm2、背部10 cm2、雞翅和雞腿各5 cm2、胸部10 cm2、腹部10 cm2）[12]涂后放入裝有50 mL磷酸鹽的EP管中，于冰盒（4 h內）運至實驗室。

1.3.2 減菌處理方法

采用50 ℃、1.5%乳酸溶液在預冷環節前對肉雞胴體沖淋15 s（以秒表計時）進行減菌處理[11]，每次沖淋12 只肉雞，分3 個批次沖淋，共沖淋36 只肉雞，并分別在胴體清洗后、預冷后、分割后及速凍后環節，用棉拭子擦拭法按1.3.1節取樣。

1.3.3 樣品預處理

將棉拭子在裝有磷酸鹽的50 mL離心管中，浸提30 min左右后取出，然后將離心管于3 000 r/min離心3 min，去除底部雜質，上清液再于12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，得菌體沉淀。

收集的菌體用5 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）懸浮，9 000 r/min離心10 min，重復洗滌3 次，洗凈的菌體懸浮在5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，用移液器吹打后振蕩器振蕩均勻，平均分裝3 份于2 mL 離心管中，-20 ℃凍存。

1.3.4 細菌總DNA提取

按照細菌DNA提取試劑盒使用說明提取細菌總DNA。將提取的細菌總DNA溶于100 μL的Tris-EDTA緩沖液，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3.5 PCR反應

用細菌16S rDNA V6～V8可變區通用引物，其上游引物為帶有GC夾子的U968，下游 引物是L1401[13]。U968-GC夾子為:5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG-GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’。下游引物L1401為:5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3’。上述引物均由成都微克天泰技術有限公司合成提供。

PCR擴增反應體系（50 μL）:DNA 模板1、0.5 μL的引物（10 μmol）、預混體系25 μL、超純水23 μL；PCR反應程序:94 ℃預變性5 min，35 個循環（94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s），最終72 ℃延伸7 min，PCR產物再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將擴增產物放于-20 ℃保存備用。

1.3.6 DGGE分析

1.3.6.1 PCR擴增所得的產物進行電泳分離

參照Muyzer等[9]的方法，對細菌16S rDNA的V6～V8區段的擴增產物進行DGGE分析并作改進。6 g/100 mL丙烯酰胺（質量分數40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺），變性劑溶液線性梯度范圍為45%～55%，先200 V電壓條件下預電泳30 min，再在120 V電壓條件下電泳16 h。

1.3.6.2 銀染與圖譜分析

DGGE電泳結束后，取出膠板，將凝膠取下先用固定液固定20～30 min，去離子水快速清洗2 次，再用AgNO3溶液避光搖床染色20～30 min，染色結束后，將凝膠從染色液中取出，用去離子水快速清洗2 次，再將凝膠放入已預冷的顯影液中搖床顯影，條帶顯色完全后，迅速取出凝膠，將其放于凝膠成像儀上成像。

1.3.6.3 克隆及序列分析

選取圖譜中清晰、明亮的優勢條帶按照Agarose Gel DNA Purifcation Kit Ver.2.0試劑盒說明割膠回收，然后再進行PCR擴增，擴增后再割膠回收，按DP214-03 Universal DNA Purification Kit試劑盒操作回收純化目的條帶，然后再取2 μL不含GC夾子的引物進行16S rDNA的V6～V8可變區域擴增，擴增后電泳檢測、再將目的條帶回收純化，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，再連接、轉化進行T克隆后，挑白斑菌落活化12～14 h后，將菌液送于上海英俊生物科技有限公司進行測序，將序列登錄NCBI，將所得序列與數據庫中的已知序列進行相似性比對。將所有序列用ClustalX（1.81）比對后，用NYSYS2軟件進行DGGE圖譜的聚類分析，最后再用MEGA 5.0軟件繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 總DNA提取及PCR擴增

用試劑盒提取方法對樣品總DNA進行提取，電泳結果如圖1所示，可以看出，樣品的總DNA提取效果較好，電泳條帶清晰可見。

以提取的總DNA為模板 ，采用U968-GC、L1401對各個樣品中細菌16S rDNA V6～V8可變區進行PCR擴增，PCR產物電泳圖如圖2所示，擴增產物電泳條帶清晰，特異性好，位于500 bp左右，均符合目的條帶約450 bp片段長度的要求。

2.2 DGGE分析

根據DGGE基本原理，圖譜中的每一根條帶都對應于微生物群落中一個優勢菌群或操作分類單位（operational taxonomic unit，OTU）[14]，且圖譜中條帶數量的多少反映了樣品中微生物組成的差 異，條帶的亮度反映了樣品中微生物的多少。對減菌前后肉雞屠宰生產鏈中脫毛、掏膛、胴體清洗、預冷、分割、速凍后的6 個環節的肉雞胴體或產品表面細菌的DGGE圖譜見圖3。可以看出，經不同加工環節后的肉雞胴體或產品表面的細菌DGGE圖譜存在一定的差異，且經50 ℃、1.5%乳酸溶液對肉雞胴體沖淋15 s處理后4 個環節中肉雞胴體或產品表面細菌的種類和數量均所減少，為進一步分析肉雞屠宰生產鏈中細菌的群落結構以及多樣性，將圖3中所標記的11 條較明顯的條帶回收純化、電泳檢測、克隆測序結果見表1。

圖3表明，在1～6肉雞屠宰加工環節中，不同加工環節之間細菌的種類與數量均有所差異。同一加工環節，不同條帶的亮度也有所差異，說明不同種類的細菌數量不同。胴體清洗環節樣品（標號3）條帶的數量最多、亮度最強，故該環節的細菌種類最為豐富、數量最多，細菌污染最嚴重；其次是分割環節樣品（標號5）中的細菌種類較豐富、數量較多；掏膛環節（標號2）中的細菌種類也較脫毛環節（標號1）豐富，數量較多；速凍環節（標號6）中的條帶數量較少，主要為幾種優勢嗜冷菌；預冷環節（標號4）中的條帶數量最少，亮度最弱，該環節細菌的種類與數量是肉雞屠宰加工環節中最少的，也是細菌污染最輕的環節。

從圖3的3-3’、4-4’、5-5’與6-6’對應加工環節減菌處理前后的DGGE圖譜可以看出，采用50 ℃ 1.5%乳酸溶液減菌處理后，每個環節條帶的數量均有較大程度的減少，條帶的亮度也均有減弱，有些條帶甚至消失。在胴體清洗環節與分割環節，經減菌處理后條帶的數量減少最多，亮度減弱程度最大。而在預冷環節，減菌后幾乎所有的條帶均消失，僅存的條帶亮度也很弱。綜上可知，在肉雞屠宰加工過程中該減菌方法能有效減少胴體及產品表面的細菌種類與數量。圖4為所有樣品DGGE圖譜的聚類分析圖，樣品3’、5’與6最為相似，首先聚在一起，相似性高達0.88，說明胴體清洗和分割這2 個污染最為嚴重環節經減菌處理后，其樣品中微生物種類的多樣性與分割后速凍產品接近，這說明該處理對這2 個環節的污染控制起到了良好的效果。樣品1、2相似度為0.88，但樣品6’與其他樣品相似度最低為0.49，可能是由于減菌處理后，樣品表面部分微生物被殺滅，得到有效控制，致使該環節微生物種類最少。從圖4的3-3’、4-4’、5-5’與6-6’對應加工環節減菌處理前后PCR-DGGE聚類分析圖可知，3-3’、5-5’樣品之間，減菌后樣品的相似度較減菌前樣品的相似度高0.06；4-4’樣品之間的相似度均為0.75，減菌前后微生物的種類基本保持一致；6-6’樣品之間的相似度差異最大，減菌前樣品較減菌后樣品的相似度高0.39，這可能是由于速凍環節的低溫造成部分種類微生物死亡，導致微生物種類減少。

結合圖3和表1可以看出，在不同加工環節的肉雞胴體表面所取的樣品中均存在一條明顯的共有條帶（標記為a），測序結果表明條帶a是乳桿菌屬（Lactobacillus），乳桿菌屬的最適生長溫度范圍為30～40 ℃，其廣泛分布于環境中，特別是動物、蔬菜及食品中，常寄主于鳥和脊椎動物的消化道以及哺乳動物的尿道，是一種存在于人類體內的益生菌。DGGE圖譜顯示，肉雞胴體及分割產品表面主體細菌（條帶a）含量較多，其他優勢菌種在不同的生產環節中豐度有所差異。胴體清洗環節樣品（標號3）條帶的數量最多、亮度最強，意味著此環節的細菌種類最為豐富、數量最多。條帶b為不可培養細菌（uncultured bacterium），在胴體清洗環節和預冷環節數量較多，減菌處理后，在胴體清洗環節消失，但在預冷環節又生長，很可能是由于預冷池中的水交叉污染所致。條帶c為腸桿菌科細菌（Enterobacteriaceae bacterium），由圖3可以看出，在肉雞生產鏈中調查的6 個環節中，均有腸桿菌科 細菌的存在，但在胴體清洗環節、分割環節和速凍環節存在的數量較多，在其他環節條帶c亮度較弱；減菌處理后條帶c的亮度明顯減弱，說明乳酸結合熱水沖淋肉雞胴體能有效減少腸桿菌科細菌。條帶d、f分別是不可培養梭菌（uncultured Clostridiales bacterium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus），同樣也是在胴體清洗環節條帶亮度最強，說明這2種菌的含量較高。條帶e、g均為不可培養細菌（uncultured bacterium），在脫毛環節、胴體清洗環節和分割環節污染也較嚴重，減菌處理后速凍環節兩條帶的亮度也幾乎消失。條帶h為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），由圖3可以看出，在肉雞屠宰生產鏈中的胴體清洗環節、分割環節和速凍環節污染較嚴重，減菌處理后在分割環節假單胞菌屬的數量有所減少，但速凍后數量又有所上升，可能是分割環節中由于環境、刀具等的交叉污染所引起的。在脫毛、掏膛、胴體清洗、分割環節還有熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）（條帶i）的存在，減菌處理后，條帶i的亮度明顯減弱，說明處理后此種細菌的數量明顯減少。條帶j為不可培養瘤胃球菌屬（uncultured Ruminococcus sp.），處理后，其數量相對于減菌前也明顯減少。條帶k為不可培養假單胞菌屬（uncultured Pseudomonas sp.），在胴體清洗環節和速凍環節污染較嚴重。

圖5為減菌前后肉雞屠宰生產鏈中胴體表面所取樣品經DGGE分析后所分離純化細菌的微生物系統發育樹，不同環節的肉雞胴體表面的微生物污染存在差異性。菌k和h的親緣關系比較近，菌k是在胴體清洗環節和速凍環節出現的細菌，菌h在調查的6 個環節中均有出現；菌h和i、k是也是同一屬的菌群，均是假單胞菌屬，i在胴體清洗和分割環節數量較多。

3 結論與討論

PCR-DGGE技術可檢測出肉雞屠宰生產鏈關鍵環節中的肉雞胴體表面細菌菌相的多樣性,DGGE圖譜顯示,采用50 ℃、1.5%乳酸溶液在預冷環節前對肉雞胴體沖淋15 s進行減菌處理,減菌后在對應肉雞加工環節大多數條帶的亮度有所減弱,且條帶數目也有所減少,由此可知,肉雞胴體表面的細菌種類及數量較減菌前均有所減少。預冷環節后,細菌的種類與數量是整個肉雞屠宰加工環節最低的,說明預冷環節能有效減少細菌的種類和數量,但也應當及時更新預冷池中的水,防止交叉污染。經預冷后,肉雞進入分割車間,細菌的種類和數量均增加,引起細菌菌相發生變化,在實際生產過程中采取適當的清洗、消毒手段可有效控制交叉污染造成的微生物污染。

本實驗中DGGE圖譜顯示不可培養梭菌(uncultured Clostridiales bacterium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)在除預冷環節外均有發現。這與Gong Jianhua等[15]研究結果相符,其發現Clostridiales和Ruminococcus在肉雞盲腸中分別占所有菌群的40%和6%。在肉雞胴體表面被檢測出的原因可能是由于盲腸在掏膛環節被弄破,導致腸道菌群在胴體清洗時被沖洗到肉雞胴體表面,但在處理后條帶亮度明顯減弱,且處理后在速凍環節這2 條帶幾乎消失,說明減菌處理后,這2 種菌的數量明顯減少。此外,乳桿菌屬、腸桿菌科與假單胞菌屬細菌是肉雞屠宰加工環節中的優勢腐敗菌。

傳統的培養法是應用選擇性培養基 篩選特定的某一類微生物,根據菌數來判斷優勢菌的變化情況[16-18],工作量大而又繁瑣,且鑒定的微生物種類十分有限。PCRDGGE技術也存在固有的局限性[19],但可以通過測序分析鑒定微生物的種類,包括部分不可培養細菌,對微生物的多樣性以及變化情況認識更加清晰、準確。孫彥雨等[20]為避開傳統培養法與PCR-DGGE技術的局限性,采用二者相結合的方法,確定乳酸菌、大腸菌群、肉桿菌、腐敗希瓦氏菌以及熱殺索絲菌為冰鮮雞肉中腐敗優勢菌,該結果與梁榮蓉[21]以及本研究結果存在一定的差異,這可能是由于不同肉雞屠宰加工企業生產標準的不同與管理水平的高低造成的。

我國GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》中食品工業用加工助劑使用規定，乳酸可作為各類食品加工助劑使用且殘留量不需限定。美國食品藥物管理局現已批準1.5%～2.5%有機酸如乳酸、檸檬酸等可用于禽類加工企業中[22]。1992年，美國農業部允許劑量為8%～12%抗菌劑磷酸三鈉以噴涂或浸漬的方式用于健康無病的生冷禽類胴體，浸漬時間不超過15 s。Bourassa等[23]研究也證實，經100 g/L磷酸三鈉溶液處理的肉雞經過45 min預冷后，其沙門氏菌減少率為40%。孫京新等[24]用不同質量分數的乳酸、不同溫度的熱水和以不同的噴淋時間研究對豬肉肉色以及去微生物污染的影響，結果發現，乳酸質量分數1.5%、溫度45 ℃、時間60 s和乳酸質量分數2.0%、溫度35 ℃、時間60 s時對豬肉肉色影響不顯著，但對大腸桿菌和沙門氏菌的致死效果均顯著。其結果與彭珍等[11]實驗結果相近但又有所差異，可能是由于處理的樣品對象不同。國內外學者研究結果普遍認為，多柵欄因子減菌工藝在畜禽屠宰加工生產線上應用時，會顯著地減少微生物種類和數量[25-26]。本研究在肉雞屠宰加工中預冷環節前使用乳酸結合熱水進行減菌處理，采用PCR-DGGE技術分析其減菌處理前后細菌菌相變化規律，較為可靠、清晰地認識了該企業肉雞屠宰加工過程中細菌菌相的分布、變化情況，同時直觀地反映了該減菌方法的減菌效果，為實際生產中微生物污染的防控提供了一定的理論依據。

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Bacterial Flora before and after Bacterial Reduction during Slaughtering and Processing Broiler Chickens

XIA Xiaolong1, PENG Zhen1, LIU Shuliang1,2,*, HAN Xinfeng1,2, ZHOU Kang1,2, ZOU Likou3, LAI Haimei1
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 2. Key Laboratory of Agricultural Products Processing and Preservation Engineering of Sichuan Province, Ya’an 625014, China; 3. Laboratory of Microbiology, Dujiangyan Campus of Sichuan Agricultural University, Dujiangyan 611830, China)

The bacterial diversity of carcasses or products of broiler chickens before and after bacterial reduction during slaughter and processing was analyzed by polymerase chain reaction (PCR) amplification and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) based on the V6–V8variable regions of 16S rDNA. Broiler carcasses were rinsed with 1.5% lactic acid solution at 50 ℃ for 15 s for reducing bacteria before the pre-cooling treatment. Bacterial total DNA was extracted from the samples collected from the surface of carcasses or carcass parts before and after bacterial reduction during chicken slaughter and processing and the V6–V8regions of 16S rDNA were amplifi ed by PCR using a universal primer. The bacterial community structure was analyzed by DGGE. The results showed that the largest number of bands with the highest brightness in the DGGE profile was observed during carcass cleaning before bacterial reduction, indicating the most serious bacterial contamination, followed in turn by carcass segmentation and pre-cooling where the lowest bacterial count and the smallest number of bacterial species were obtained suggesting minimum bacterial contamination. After bacterial bacteria, both the total bacterial count and the number of bacterial species were reduced during slaughte ring and processing, as compared with those observed before bacterial bacteria. The largest reduction in the two parameters was found during both carcass cleaning and segmentation, and the smallest reduction during the pre-cooling sta ge. The bacterial species were not entirely consistent during the slaughter and processing of broilers, and Lactobacillus was found throughout the entir e process as the predominant spoilage bacteria together with Pseudomonas sp. and Enterobacteriaceae.

PCR-DGGE; chickens; slaught e r; bacterial reduction; bacterial microfl ora

TS251.8

A

10.7506/spkx1002-6630-201510038

2014-06-09

公益性行業(農業)科研專項(200903055)

夏小龍(1989—),男,碩士研究生,研究方向為食品微生物。E-mail：xiaolongxia1205@163.com

*通信作者：劉書亮(1968—),男,教授,博士,研究方向為食品微生物與發酵工程。E-mail：lsliang999@163.com