Logistic回歸和ROC曲線分析血清DKK1、GP73和AFP在原發性肝癌診斷中的價值

宗迎迎，徐 浩，許 偉，顧玉明，祖茂衡，萬豪光，吳 康

(徐州醫學院附屬醫院介入科，江蘇徐州221002)

原發性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是最常見的惡性腫瘤之一，發病率呈現上升趨勢。由于起病隱襲，早期無特異性臨床表現和體征，大多數患者在確診時已屬晚期，所以早期發現、早期治療對提高患者生存率至關重要。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是目前唯一廣泛應用于檢測PHC的血清標志物，但敏感性(40% ～65%)和特異性(76% ～96%)均不甚令人滿意[1]。有研究發現 Dickkopf同源物1(Dickkopf-1，DKK1)、高爾基體糖蛋白73(Golgi protein 73，GP73)[2-3]是值得期待的PHC血清標志物。我們通過檢測健康人及不同肝病患者DKK1、GP73和AFP表達水平，建立PHC診斷的統計模型即綜合預測模型，應用Logistic回歸和受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析DKK1、GP73、AFP及其聯合預測因子在PHC診斷中的臨床意義。

材料和方法

一、研究對象

2013年8月至2014年7月在徐州醫學院附屬醫院共收集研究對象231例，男189例，女42例，年齡 20～79歲，其中健康對照(healthy control，HC)者50 名、慢性肝炎(chronic hepatitis，CH)患者50例、慢性肝硬化(liver cirrhosis，LC)患者50例、PHC患者81例。各組研究對象在年齡、性別上差異均無統計學意義(P＞0.05)。HC人群來源于徐州醫學院附屬醫院體檢正常并排除其他慢性疾病的健康者。肝病診斷標準和腫瘤診斷標準符合2000年中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯合修訂的“病毒性肝炎防治方案”中病毒性肝炎診斷標準及中華人民共和國衛生部2011年制定的《原發性肝癌診療規范》中的肝癌診斷標準。

二、試劑和方法

DKK1、GP73測定采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，試劑分別由美國Raybiotech公司和北京熱景生物技術有限公司提供，檢測均嚴格按試劑盒說明書操作。血清AFP測定采用電化學發光免疫法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)，參考區間為0～20 ng/mL。

三、統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。GP73呈正態分布，用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法或Tamhane's T2法;DKK1、AFP呈非正態分布，用中位數和四分位數[M(P25～P75)]表示，多組之間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較用Mann-Whitney U檢驗。計數資料的比較應用χ2檢驗。篩選合適的自變量(納入標準α ＜0.05，排除標準α ＞0.1)建立肝癌診斷的Logistic回歸模型，回歸模型的擬合度采用似然比檢驗，回歸參數估計值采用Wald檢驗。根據ROC曲線及曲線下面積(the area under Roc curve，AUC)評估聯合及單項診斷的敏感性和特異性，Z檢驗比較AUC的差異，檢驗水準α=0.05。

結 果

一、各組血清DKK1、GP73和AFP檢測結果比較

PHC組DKK1、GP73和AFP水平均顯著高于CH組、LC組和HC組(P＜0.05)。見表1。

二、血清DKK1、GP73和AFP的ROC曲線分析

采用ROC曲線對 GP73、DKK1和AFP的檢測結果進行分析，見圖1。ROC曲線確定GP73、DKK1和AFP診斷PHC的臨界值分別為192.97、4.48 和 20.00 ng/mL。GP73 的敏感性為 77.8%，特異性為86.7%;DKK1的敏感性為71.6%，特異性為90.0%;AFP的敏感性為58.0%，特異性為78.7%。GP73、DKK1、AFP 聯合檢測對 PHC 的診斷敏感性為 95.1%，特異性為 72.0%。GP73 診斷PHC 的敏感性明顯優于 AFP(χ2=7.25，P ＜0.01)，特異性兩者之間差異無統計學意義(χ2=3.35，P=0.07);DKK1 診斷 PHC 的特異性優于AFP(χ2=7.29，P ＜0.01)，敏感性兩者之間差異無統計學意義(χ2=3.27，P=0.07)。GP73、DKK1、AFP三者聯合診斷PHC的敏感性均優于單獨檢測(χ2=10.31，P=0.01;χ2=16.04，P ＜ 0.01;χ2=30.94，P ＜0.01)，而特異性明顯低于 GP73、DKK1(χ2=9.84，P ＜0.01;χ2=15.79，P ＜0.01)，與 AFP相比差異無統計學意義(χ2=1.79，P=0.18)。

表1 各組血清DKK1、GP73和AFP檢測結果的比較 (ng/mL)

圖1 GP73、DKK1、AFP和Logistic回歸模型檢測PHC的ROC曲線

三、PHC診斷模型的構建

以肝病狀態(PHC組、非PHC組)為應變量，血清DKK1、GP73、AFP測定結果為自變量，建立Logistic回歸模型。本研究模型中各參數的擬合結果見表2。因此得到的模型可表示為 Logit(Ⅱ)= －9.492+0.002×AFP+0.023×GP73+1.058×DKK1。

該模型經過似然比檢驗，此回歸模型具有統計學意義(χ2=160.06，P ＜0.01)。用 ROC 曲線法對上述模型進行診斷價值分析，結果見圖1，AUC 為0.93，95%可信區間為 0.89 ～0.97，臨界值為0.57，敏感性和特異性分別為 87.7%和90.0%。

表2 AFP、DKK1、GP73聯合檢測PHC的Logistic模型擬合參數

四、DKK1、GP73、AFP及PHC診斷模型AUC比較

單獨用于PHC診斷，DKK1和GP73的AUC均明顯大于AFP(P均=0.01)，DKK1與GP73的AUC差異無統計學意義(P=0.79);綜合AFP、DKK1、GP73診斷 PHC，Logistic回歸模型的AUC分別顯著大于 AFP、DKK1和 GP73(P均 ＜0.01)。見表3。

表3 AFP、DKK1、GP73及三者聯合診斷PHC的AUC比較

討 論

PHC是世界第5大常見癌癥，其致死率高居世界第3位[4]。而在我國，根據最新公布的2012年《中國腫瘤登記年報》，PHC的發病率居第4位，而病死率高居第2位[5]。PHC起病隱匿，早期多無明顯的癥狀、體征，發現時多數已為中晚期，如不予以積極治療，自然病程較短，總體5年生存率＜5%[6]。而早期發現、早期診斷、早期治療可顯著提高患者的5年生存率。AFP是目前診斷PHC最重要的腫瘤標志物，已被廣泛用于PHC的普查、診斷、判斷治療效果和預測復發，然而其敏感性和特異性均不令人滿意，肝硬化結節、脂肪浸潤、不典型肝臟炎性病灶及罕見的肝臟良性病變等均可發生AFP升高，且AFP陰性或低滴度陽性肝癌亦無法與肝臟良性病變鑒別[7]。近年來，基因技術、蛋白質組學、腫瘤免疫等方面的研究飛速發展，發現了一系列新的、潛在的腫瘤標志物，其中DKK1、GP73被認為是值得期待的血清標志物。

DKK1是位于人類染色體10q11.2、編碼1個長約266氨基酸、相對分子質量為28.7×103的分泌型蛋白，其作為Wnt信號轉導通路的拮抗劑，在多種腫瘤發生、發展過程中起著重要作用[8]。本研究發現DKK1在PHC患者中的表達高于HC者及 CH、LC 患者，與陳國棟等[9]及 SHEN 等[10]研究結果一致。最近 CANEPARO等[11]亦發現，DKK1可通過與細胞表面的硫酸乙酰肝素類蛋白多糖蛋白結合，激活非經典的Wm/平面細胞極性(planar cell polority，PCP)通路，促進了肝癌的發生、發展過程，并且多項研究表明硫酸乙酰肝素類蛋白多糖蛋白在肝細胞癌中表達明顯上調[12]。目前有新的研究提出DKK1對PHC診斷的敏感性、特異性均優于AFP[10]。在本研究中，DKK1以4.48 ng/mL為臨界值時，其敏感性為71.6%，特異性為90.0%，DKK1診斷PHC的特異性優于AFP(P＜0.01)，而敏感性與AFP相比差異無統計學意義(P=0.07)，考慮是DKK1高表達可能存在多種途徑所致，不僅由乙型肝炎病毒感染引起，但因本研究中丙型肝炎病毒和未合并病毒感染的肝癌病例偏少，不能排除檢驗效能的影響，因此仍需擴大樣本量進行驗證。

GP73是一種Ⅱ型高爾基體跨膜蛋白，KLADNEY等[13]于2000年首先闡述了其在正常情況下主要由膽管上皮細胞表達，而在肝細胞中表達很少甚至不表達。隨后，KLADNEY等[14]發現病毒(乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒)感染和非病毒(酒精性及自身免疫性肝病)引起的急、慢性肝病患者血清中GP73表達上調。BLOCK等[15]于2005年首先提出，在肝癌患者血清中GP73水平顯著升高。本研究結果顯示PHC組GP73含量明顯高于CH和LC組，與施前鋒等[16]和吳巧萍等[17]的研究結果一致。而陳文莉等[18]的研究結果顯示肝癌、LC及肝炎患者間血清GP73水平無差異，還有一些研究認為LC患者血清GP73水平高于 PHC 患者[7，19-20]，與本研究結果相反，這種情況可能是參與這些研究的PHC和LC患者肝損傷的程度不同所致。以GP73＞192.97 ng/mL為臨界值時，其敏感性為77.8%，特異性為86.7%，作為診斷PHC的血清指標，GP73的敏感性優于AFP，與國內外文獻報道[10，16-17，21]一致。

本研究建立PHC診斷模型，應用Logistic回歸模型的似然比檢驗表明模型的擬合優度較好，采用對模型預報能力判斷的ROC曲線對模型進行分析，通過Logistic回歸擬合得到聯合預測因子，以聯合預測因子為診斷指標分析其對PHC的診斷價值。聯合預測因子診斷PHC時的AUC高于GP73、DKK1或AFP單項檢測，在統計學上聯合預測因子的AUC與GP73、DKK1、AFP單項檢測相比差異有統計學意義(P＜0.01)。診斷模型AUC 為 0.93(95%可信區間 0.89 ～0.97)，其敏感性和特異性分別為87.8%和90.0%。AUC越大，診斷的價值越大，AUC＞0.9時表示診斷有較高的準確性[22]。

綜上所述，DKK1和GP73是新一代肝癌診斷標志物，聯合檢測為診斷PHC提供了有效途徑，可用于PHC高危人群的普查和篩選。ROC曲線分析結合Logistic回歸簡單、有效，可用于PHC多指標聯合診斷的分析評價。本研究也存在一些不足之處:(1)本研究是一個單中心小樣本的研究;(2)本研究為非隨機對照研究，盡管在研究前對患者的基礎資料進行了匹配，但難免會存在一些樣本誤差。因此，需要更大樣本的隨機對照研究進一步驗證這些腫瘤標志物對PHC的診斷價值。

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