快速冰凍切片在手術(shù)中的應(yīng)用與改進(jìn)

快速冰凍切片是利用低溫冷凍技術(shù)使待檢組織變硬，以代替石蠟包埋，進(jìn)行組織制片的方法[1，2]。1818年Fleterdeffiemer首創(chuàng)冰凍切片技術(shù)，1891年Halsted和Accop將冰凍切片技術(shù)列為正式診斷方法。此種技術(shù)可以在幾秒或幾分鐘內(nèi)將組織冷凍好，無需固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等繁雜的組織處理程序[3]。快速冰凍切片是臨床醫(yī)生在實(shí)施手術(shù)過程中，就與手術(shù)方案有關(guān)的診斷問題請求病理醫(yī)師快速進(jìn)行的緊急會(huì)診?？s短冰凍切片及染色時(shí)間，提高冰凍切片質(zhì)量，是病理醫(yī)師進(jìn)行準(zhǔn)確診斷的重要環(huán)節(jié)，也是臨床醫(yī)師及時(shí)決定治療方案的關(guān)鍵所在[4]。因此怎樣快速做好冰凍切片也是病理技師面臨的一個(gè)重要問題。

1資料與方法

1.1一般資料選用2011年1月~2013年12月我院手術(shù)切除的新鮮腎臟、乳腺、甲狀腺、子宮附件、肝臟、肺臟、胃食管、淋巴結(jié)等標(biāo)本1800例（所有組織均為術(shù)中新鮮切除并立即送檢制作冰凍切片），并與術(shù)后的病理活檢進(jìn)行對比，對術(shù)中標(biāo)本快速冰凍切片檢查準(zhǔn)確率進(jìn)行評價(jià)。德國萊卡CM1900冰凍切片機(jī)、組織托、OCT包埋劑、一次性刀片、固定液。

1.2方法開機(jī)預(yù)冷：提前開機(jī)，將低溫恒冷切片機(jī)冷臺(tái)及切片刀冷至-22℃左右；滴加包埋劑：在改進(jìn)后的組織包埋托上滴加包埋劑，待冷凍好后修平，將微小組織平放于修好的平面上，冷凍片刻，修切，若是長條組織，如腎穿刺標(biāo)本，組織與組織包埋托旋鈕呈60°角，若是多塊組織則應(yīng)放置于同一平面，且不互相重疊；切片：用手術(shù)刀片切去組織周圍多余的包埋劑，使之成為長方形或正方形，然后開始切片，切片厚度3~5μm；固定：95%乙醇或乙醚酒精混合液（乙醚與95%乙醇等量混合）固定5~10s；染色：蘇木素1~2min，0.5%鹽酸酒精分化1s，0.25%氨水返藍(lán)，伊紅染1min，95%乙醇3s，無水乙醇3s，在烘片機(jī)上烤干，封片。

2結(jié)果

2011年1月~2013年12月，共1800例快速冰凍組織病理切片，整個(gè)制片過程約需15～20min，切片平整，厚薄均勻，無皺褶，鏡下細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，對比鮮艷清晰，細(xì)胞無腫脹，無收縮，切片無冰晶。與術(shù)后石蠟包埋組織病理切片的觀察、對照，層次分明，分辨率良好，纖維成分多、脂肪組織少的組織用快速冰凍病理切片與常規(guī)石蠟病理切片HE染色效果基本相似，脂肪組織多的組織用冰凍快速病理切片與常規(guī)石蠟病理切片HE染色具有一定差異，總診斷準(zhǔn)確率為97.39%，見表1。

3討論

快速冰凍切片是手術(shù)中病理診斷的方法之一，具有較廣泛的應(yīng)用，在很大程度上決定了手術(shù)的方式和治療方案的確定，因此質(zhì)量較好的冰凍切片，對病理醫(yī)生和臨床醫(yī)生都至關(guān)重要。

恰當(dāng)?shù)臉?biāo)本取材，對快速冰凍切片的制作尤為重要。送檢組織不需固定，避免遇水，如本身含水分較多，應(yīng)用濾紙吸干，目的在于防止切片產(chǎn)生空洞、冰晶；取材組織塊厚度不超過3mm，理想取材大小為15mm×15mm×3mm，防止冷凍時(shí)間過長造成組織干、硬、脆[1，5]。

關(guān)于切片的冷凍溫度，應(yīng)根據(jù)組織大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)組成的不同調(diào)節(jié)不同的溫度。溫度過低，組織塊硬，切片碎裂；溫度過高，組織塊硬度不夠，切片不成形。所以要獲得一張既薄又完整的切片，控制最佳溫度很關(guān)鍵。我們的經(jīng)驗(yàn)是：微小組織-18℃～-19℃；囊壁樣組織-26℃～-28℃；甲狀腺、淋巴結(jié)、腦-18℃～-20℃；乳腺、脂肪含量高的腫瘤-28℃～-30℃；皮膚、纖維、肌肉-23℃～-25℃[6]。

切片時(shí)，應(yīng)注意組織塊冷凍變硬或OCT未完全固化時(shí)切片，冷凍過度切片易粉碎。切片前檢鍘刀座和防卷板的螺絲是否緊固、刀的角度是否正確。切片時(shí)進(jìn)刀要緩慢，修平組織到最大面，然后把防卷板調(diào)至與刀刃平行，使切片能順利通過，選最佳切片貼附在載玻片上，貼片求時(shí)動(dòng)作要輕，不能壓印在組織上，要先讓切片的一端吸附后緩緩向下移動(dòng)，使切片貼附的平整。切片過程中切不可長時(shí)間打開冷凍機(jī)的門窗，以免熱空氣進(jìn)入冷凍箱內(nèi)，影響切片[7，8]。

關(guān)于固定，其作用在于使蛋白變性、凝固、沉淀，終止或抑制酶活性，保存細(xì)胞、組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性，此外還兼有硬化和媒染效果。對于不同的組織和抗原成分，需選擇合適的固定劑、適宜的溫度和時(shí)間。蛋白類抗原用丙酮固定，多糖類抗原用乙醇固定效果比較好，為了兼顧兩者，我室采用4℃冷丙酮與無水乙醇1：1的混合液固定10min～15min，用于冰凍切片的免疫組化，效果較好；而快速病理切片用冷丙酮固定1min～2min即可。采用浸入法和滴加法固定均可[3-5，9]。

HE染色，切片從固定液中取出，速水洗，滴上少許蘇木素，于酒精燈上加熱染色，當(dāng)有蒸汽時(shí)即可中止染色，然后水洗，1%鹽酸酒精分化，溫水促藍(lán)，伊紅對比染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。注意嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟操作進(jìn)行，防止脫片；水流不能過激，以免沖壞組織完整性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察[8]。

總之，快速冰凍切片是較難掌握的病理技術(shù)之一，為了不漏診、誤診，及時(shí)準(zhǔn)確地作出診斷，有效地配合臨床醫(yī)生的治療，必須注意制片的技巧的改進(jìn)，不斷提高改進(jìn)制片技能與技術(shù)，同時(shí)也需根據(jù)不同的標(biāo)本做合適的出來，盡可能做出質(zhì)量合格的切片，以提高診斷的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn):

[1]張敏.快速冰凍切片在臨床手術(shù)中應(yīng)用[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010(17):2769.

[2]朱惠君，楊其昌.手術(shù)中快速冰凍切片及相關(guān)問題[J].江蘇醫(yī)藥，2005(12):953.

[3]章華元，吳雯，吳靜.術(shù)中淋巴結(jié)快速冰凍切片的制作[J].河南腫瘤學(xué)雜志，1999(04):344.

[4]許平.快速冰凍切片制備方法的改進(jìn)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010(02):241-243.

[5]楊月紅，袁永輝.快速冰凍切片的幾點(diǎn)體會(huì)[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2005(01):51-52.

[6]趙鐵.術(shù)中快速冰凍切片的點(diǎn)滴經(jīng)驗(yàn)[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2012(09):1032.

[7]汪育苗.術(shù)中快速冰凍切片的制作方法及體會(huì)[J].北京口腔醫(yī)學(xué)，2011(01):52-53.

[8]賈曉敏.術(shù)中快速冰凍切片免疫組化染色研究[J].臨床醫(yī)藥實(shí)踐，2013(01):36-37.

[9]梁忠泉，袁昌隆，張寶賀.微小組織快速冰凍切片法[J].中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2009(07):654.

編輯/申磊