快速冰凍切片在手術中的應用與改進

快速冰凍切片是利用低溫冷凍技術使待檢組織變硬，以代替石蠟包埋，進行組織制片的方法[1，2]。1818年Fleterdeffiemer首創冰凍切片技術，1891年Halsted和Accop將冰凍切片技術列為正式診斷方法。此種技術可以在幾秒或幾分鐘內將組織冷凍好，無需固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等繁雜的組織處理程序[3]?？焖俦鶅銮衅桥R床醫生在實施手術過程中，就與手術方案有關的診斷問題請求病理醫師快速進行的緊急會診。縮短冰凍切片及染色時間，提高冰凍切片質量，是病理醫師進行準確診斷的重要環節，也是臨床醫師及時決定治療方案的關鍵所在[4]。因此怎樣快速做好冰凍切片也是病理技師面臨的一個重要問題。

1資料與方法

1.1一般資料選用2011年1月~2013年12月我院手術切除的新鮮腎臟、乳腺、甲狀腺、子宮附件、肝臟、肺臟、胃食管、淋巴結等標本1800例（所有組織均為術中新鮮切除并立即送檢制作冰凍切片），并與術后的病理活檢進行對比，對術中標本快速冰凍切片檢查準確率進行評價。德國萊卡CM1900冰凍切片機、組織托、OCT包埋劑、一次性刀片、固定液。

1.2方法開機預冷：提前開機，將低溫恒冷切片機冷臺及切片刀冷至-22℃左右；滴加包埋劑：在改進后的組織包埋托上滴加包埋劑，待冷凍好后修平，將微小組織平放于修好的平面上，冷凍片刻，修切，若是長條組織，如腎穿刺標本，組織與組織包埋托旋鈕呈60°角，若是多塊組織則應放置于同一平面，且不互相重疊；切片：用手術刀片切去組織周圍多余的包埋劑，使之成為長方形或正方形，然后開始切片，切片厚度3~5μm；固定：95%乙醇或乙醚酒精混合液（乙醚與95%乙醇等量混合）固定5~10s；染色：蘇木素1~2min，0.5%鹽酸酒精分化1s，0.25%氨水返藍，伊紅染1min，95%乙醇3s，無水乙醇3s，在烘片機上烤干，封片。

2結果

2011年1月~2013年12月，共1800例快速冰凍組織病理切片，整個制片過程約需15～20min，切片平整，厚薄均勻，無皺褶，鏡下細胞形態清晰，細胞核呈藍色，細胞質呈紅色，對比鮮艷清晰，細胞無腫脹，無收縮，切片無冰晶。與術后石蠟包埋組織病理切片的觀察、對照，層次分明，分辨率良好，纖維成分多、脂肪組織少的組織用快速冰凍病理切片與常規石蠟病理切片HE染色效果基本相似，脂肪組織多的組織用冰凍快速病理切片與常規石蠟病理切片HE染色具有一定差異，總診斷準確率為97.39%，見表1。

3討論

快速冰凍切片是手術中病理診斷的方法之一，具有較廣泛的應用，在很大程度上決定了手術的方式和治療方案的確定，因此質量較好的冰凍切片，對病理醫生和臨床醫生都至關重要。

恰當的標本取材，對快速冰凍切片的制作尤為重要。送檢組織不需固定，避免遇水，如本身含水分較多，應用濾紙吸干，目的在于防止切片產生空洞、冰晶；取材組織塊厚度不超過3mm，理想取材大小為15mm×15mm×3mm，防止冷凍時間過長造成組織干、硬、脆[1，5]。

關于切片的冷凍溫度，應根據組織大小、形態結構和性質組成的不同調節不同的溫度。溫度過低，組織塊硬，切片碎裂；溫度過高，組織塊硬度不夠，切片不成形。所以要獲得一張既薄又完整的切片，控制最佳溫度很關鍵。我們的經驗是：微小組織-18℃～-19℃；囊壁樣組織-26℃～-28℃；甲狀腺、淋巴結、腦-18℃～-20℃；乳腺、脂肪含量高的腫瘤-28℃～-30℃；皮膚、纖維、肌肉-23℃～-25℃[6]。

切片時，應注意組織塊冷凍變硬或OCT未完全固化時切片，冷凍過度切片易粉碎。切片前檢鍘刀座和防卷板的螺絲是否緊固、刀的角度是否正確。切片時進刀要緩慢，修平組織到最大面，然后把防卷板調至與刀刃平行，使切片能順利通過，選最佳切片貼附在載玻片上，貼片求時動作要輕，不能壓印在組織上，要先讓切片的一端吸附后緩緩向下移動，使切片貼附的平整。切片過程中切不可長時間打開冷凍機的門窗，以免熱空氣進入冷凍箱內，影響切片[7，8]。

關于固定，其作用在于使蛋白變性、凝固、沉淀，終止或抑制酶活性，保存細胞、組織原有的形態結構和抗原性，此外還兼有硬化和媒染效果。對于不同的組織和抗原成分，需選擇合適的固定劑、適宜的溫度和時間。蛋白類抗原用丙酮固定，多糖類抗原用乙醇固定效果比較好，為了兼顧兩者，我室采用4℃冷丙酮與無水乙醇1：1的混合液固定10min～15min，用于冰凍切片的免疫組化，效果較好；而快速病理切片用冷丙酮固定1min～2min即可。采用浸入法和滴加法固定均可[3-5，9]。

HE染色，切片從固定液中取出，速水洗，滴上少許蘇木素，于酒精燈上加熱染色，當有蒸汽時即可中止染色，然后水洗，1%鹽酸酒精分化，溫水促藍，伊紅對比染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。注意嚴格按實驗步驟操作進行，防止脫片；水流不能過激，以免沖壞組織完整性，影響實驗結果的觀察[8]。

總之，快速冰凍切片是較難掌握的病理技術之一，為了不漏診、誤診，及時準確地作出診斷，有效地配合臨床醫生的治療，必須注意制片的技巧的改進，不斷提高改進制片技能與技術，同時也需根據不同的標本做合適的出來，盡可能做出質量合格的切片，以提高診斷的準確性。

參考文獻:

[1]張敏.快速冰凍切片在臨床手術中應用[J].齊齊哈爾醫學院學報，2010(17):2769.

[2]朱惠君，楊其昌.手術中快速冰凍切片及相關問題[J].江蘇醫藥，2005(12):953.

[3]章華元，吳雯，吳靜.術中淋巴結快速冰凍切片的制作[J].河南腫瘤學雜志，1999(04):344.

[4]許平.快速冰凍切片制備方法的改進[J].鄭州大學學報(醫學版)，2010(02):241-243.

[5]楊月紅，袁永輝.快速冰凍切片的幾點體會[J].實用醫技雜志，2005(01):51-52.

[6]趙鐵.術中快速冰凍切片的點滴經驗[J].醫學理論與實踐，2012(09):1032.

[7]汪育苗.術中快速冰凍切片的制作方法及體會[J].北京口腔醫學，2011(01):52-53.

[8]賈曉敏.術中快速冰凍切片免疫組化染色研究[J].臨床醫藥實踐，2013(01):36-37.

[9]梁忠泉，袁昌隆，張寶賀.微小組織快速冰凍切片法[J].中國療養醫學，2009(07):654.

編輯/申磊