TRFIA與ELISA法檢測乙肝病毒血清學標志物注意事項

摘要：為了保證時間分辨免疫熒光法( TRFIA) 和酶聯免疫吸附試驗( ELISA) 對乙型肝炎病毒標志物檢測的質量控制，本文分別分析了兩種檢測方法的各自特點和注意事項，有助于檢測人員對分析檢測結果是否受到干擾提高判斷和處理干擾因素的能力，保證檢驗結果的準確性。

關鍵詞：TRFIA; ELISA; 乙型肝炎病毒血清標志物；注意事項

TRFIA and ELISA Serological Markers for the Detection of HBV

GUO Yi

(Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530000，Guangxi，China)

Abstract：In order to ensure the time-resolved fluorescence immunoassay (TRFIA) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the quality control of hepatitis B virus marker detection， this paper analyzed the characteristics of two kinds of detection method and the matters needing attention， helps to detect personnel on the analysis of results in detection of whether interference and improve judgment processing of interference factors， to ensure the accuracy of test results.

Key words： TRFIA; ELISA; Hepatitis B virus serum markers; Matters needing attention乙肝是一種常見的肝病，ＨＢＶ的早期發現與確診，臨床主要依據實驗室肝炎病毒標志物的檢測，ＨＢＶ檢測目前實驗室檢測血清乙肝兩對半普遍使用時間分辨免疫熒光法( TRFIA) 和酶聯免疫吸附試驗( ELISA)，本文分別討論兩種檢測方法的各自特點和注意事項，可以幫助檢測人員在實驗過程中分析是否受到干擾提高判斷和處理干擾因素的能力，有效保證檢驗結果的準確性。

1 TRFIA

是用獨特熒光特性的鑭系稀土金屬及其螯合劑作為示蹤物，以此用來標注抗體鄧這些活性細胞，也就是反應體系，等待反應體系發生之后，用時間來分辨螢光強度，用螢光強度的相對比值來確定這些反應體系中的分析物的濃密度，靠這種方法來達到定量分析的目標。 作為一種高靈敏度免疫學檢查技術，具有高靈敏度、高穩定性、線性范圍寬、可定量等優點，目前臨床使用越來越多地選擇 TRFIA 檢測乙肝標志物，做好其的室內質量控制就顯得非常重要，總結以下幾點注意事項：

1.1 測量時要嚴格按照儀器操作規程進行操作，操作前儀器狀態自檢良好才可以檢測，每次檢測均進行不少與5點定標，每個標點重復測定n次，取其平均值擬合劑量-反應曲線計算結果，結果中標準曲線相關系數應（r）值≥ 0.99。

1.2購買衛生部臨床檢驗中心提供的標量質控品，制作質控圖，在儀器最佳條件下，對該批質控品反復測定（至少20份），計算出20個結果的X、標準差S， X±2S作為上警戒限和下警戒限；X±3S作為控制圖的上控制限和下控制限，選擇質控規則時必須兼顧在免疫學檢驗中常采用6個質控規則，即12s，13s，22s，R4s，41s，10X質控規則。失控，所謂的失控就是限定或超出某一規定范圍，這個范圍的界定是以12s規則作為警告規則啟動13s，22s，R4s，41s，10X系列質控規則的，當數據在范圍內的，判斷為在控，當數據在范圍之外的，判斷為失控，這個界定的規則也會出現誤差，當系統的誤差太大時，就會由規則13s檢出。

1.3統計計算批內、批間標準品檢測值，計算精密度，精密度要滿足方法的要求。

1.4計算測量過程中的不確定度。一切測量都不可避免地存在誤差，因此，一個完整的測量結果不僅要包含被測的數值和單位，還應包含對測量結果的可信賴程度評定的數值。不確定度指的是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯系[1]。分為A類和B類，不確定度計算要建立數學模式，主要來源: 樣品重復測量不確定度（A類），標準溶液的不確定度，標準曲線不確定度，分析儀器的不確定度。

2酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

是一種常用的固相酶免疫測定方法，是在放射免疫分析理論的基礎上發展起來的一種非放射性標記免疫技術，具有簡便、快速、消耗成本低[2]，在很多基層試驗室仍然使用，這樣會就收到了方法學自身的限定，只能作為陰陽性方面的判斷，不能測到乙肝上面具體的兩對半的含有量。這個不可能作為動態學上感染的臨床觀察，遠遠不能達到診斷的效果。在這個測定中其他的不定性的干擾信號太多，并且這個也有技術含量在里面，會導致檢測結果不準確，干擾因素主要有標本、試劑、人為操作三方面的原因，

2.1標本采集①溶血:因Hb中富含有血紅素基因， 這種基因是一種過氧化物活性物質， ELISA 是以HRP為標記，如標本中的Hb太多，容易吸附在固相與底物發生顯色反應，假陽性結果出現；②標本凝固性不好或放置時間太長，也會出現異常的效果；③細菌污染，采血試管清洗不夠干凈、 經常使用會出現交叉性污染; 也可能造成假陰性。最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管;④正常血液采集冷凍標本反復凍融:這會使抗體效價下降；⑤干擾物質 有人認為大約４０％的人血清標本中含有非特異性干擾物質，可以不同程度影響檢測結果，常見的干擾物質有類風濕因子、補體/嗜異性抗體交叉反應物質和其他物質等，某些自身抗體都會影響結果造成假陽性[2]。

2.2試劑因素對于試劑來說，對試劑質量的選擇也存在很大的關系，因為質量對檢測水平起著重要的作用。選取時可以根據試劑的歷史性評價和以往的臨床上的效果，以及方法等多方面來篩選[3]。

2.3 操作因素存在問題：加樣量不準確，孵育、洗板、顯色、結果判讀時間不準，孵育溫度過高或過低，孵育環境未避光， 洗板不干凈，未做陰、陽對照及復查臨界及可疑標本。工作中加樣器也要經常清洗，定期校準，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中， 減少受熱不均， 貼密封膜， 防止污物浸入，洗板檢測結果密切相關，注意避免孔與孔之間液體交叉污染，拍干，要注意配制好的洗滌液的有效期，不應使用過期的洗滌液進行洗滌。

總體看，ELISA比較適合臨床乙型肝炎的初篩，價格便宜；TRFIA法可以定量，對乙型肝炎病毒感染的診斷、分型、治療和療效評價具有重要作用，其靈敏度和準確性較高，漏診發生率較低，檢測費用昂貴，所以在臨床上對于HBSAg選擇何種檢測方法，還要結合醫院和受檢者的實際情況進行選擇。在檢測過程中檢驗人員除有高度責任心，熟練規范操作外，還要熟知檢測方法中的注意事項，懂得判斷檢測結果是否受到干擾，如何處理這些干擾因素，才能保證檢驗結果的準確性。

參考文獻：

[1] 王支蘭.EL ISA 試驗的質量控制[J].現代預防醫學， 2004， 31(11481) .

[2] 胥鳳.西藏高原地區應用ELISA方法檢測乙肝兩對半的技術要點與常見問題探討[J].西藏科技2012.5.

[3]賈志遠， 余陶， 田瑞光，等. 四種乙肝病毒表面抗原 ELISA 診斷試劑的評價[J] . 中華實驗和臨床病毒學雜志， 2006，20(4): 384 -386.編輯/王海靜