冬凌草甲素對NCI-H460肺癌細胞凋亡相關蛋白的影響

肺癌在我國已經成為癌癥死亡的首要病因。冬凌草甲素是從冬凌草中提取出來的天然化合物，其分子式為C12H28O6，具有抗腫瘤活性，能誘導多種腫瘤細胞凋亡[1]。本文旨在探討冬凌草甲素促進肺癌細胞凋亡的作用機制，為肺癌的治療提供理論依據。

1資料

肺癌細胞株NCI-H460細胞購自中國科學院細胞研究所。冬凌草甲素（純度≥98%）購自上海詩丹德生物技術有限公司。RPMI 1640購自Gibco公司；噻唑藍（Thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）及二甲基亞砜購自Sigma公司；兔抗鼠IgG抗體及鼠抗人β-actin、livin、survivin抗體購自Santa Cruz公司；Western-blot Luminol(ECL)試劑盒購自Santa Cruz公司。

2方法

2.1細胞培養NCI-H460肺癌細胞接種于含10%小牛血清的RPMI 1640培養基中，于37℃、體積分數5%CO2的培養箱中培養。取對數生長期的細胞進行實驗，分為對照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組，分布加入冬凌草甲素使終濃度為0、8、16、24μmol/L。

2.2凋亡細胞的形態學觀察采用Hoechst33342/PI熒光雙重染色。培養細胞中加入Hoechst33342，終濃度為5μg/ml，37℃避光染色10min，加入PI染液，終濃度為15μg/ml，4℃避光反應10min，熒光顯微鏡下觀察。

2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡收集1×105個細胞，用冷PBS洗滌細胞兩次，細胞重懸后Hoechst33342/PI染色，1h內用流式細胞儀檢測凋亡。其中活細胞僅有很低的熒光強度，凋亡細胞有較強的綠色熒光，壞死細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

2.4 Western blot檢測livin、survivin表達收集4組細胞，將每組細胞1×106個裂解，提取蛋白，測定蛋白濃度；用SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1h，加入鼠抗人β-actin、livin、survivin抗體，再加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG抗體，進行ECL反應顯影并曝光，用Quality One軟件分析條帶相對吸光度值（靶蛋白吸光度/β-actin吸光度），比較蛋白表達水平。

2.5 統計學處理實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，用SPSS 17.0軟件進行數據的統計分析。多組資料間的比較用方差分析，檢驗水準α=0.05。

3結果

3.1凋亡細胞的形態學變化熒光顯微鏡下觀察，對照組僅有很低的熒光強度，實驗組出現有較強綠色熒光的凋亡細胞和有紅綠雙重熒光的壞死細胞。凋亡細胞變圓或皺縮，細胞膜完整，部分細胞核內染色質濃縮成塊狀、分葉狀或形成粗細不均勻的碎塊并相互分離，不均勻地分散于細胞質中，胞質中出現空泡，形成凋亡小體。說明冬凌草甲素具有促進NCI-H460細胞凋亡的作用。

3.2細胞凋亡率檢測冬凌草甲素作用24h、48h、72h時，實驗組細胞凋亡率均高于對照組（P<0.05），表明冬凌草甲素能有效誘導NCI-H460細胞凋亡，低濃度組、中濃度組和高濃度組之間凋亡率有顯著性差異，隨冬凌草甲素濃度的增大，細胞凋亡率也相應升高，表明冬凌草甲素誘導NCI-H460細胞凋亡的作用具有劑量依賴性（圖1）。

圖1 細胞凋亡率測定

3.3 Western blot檢測livin、survivin表達4組均有survivin和livin的不同程度的表達，以靶蛋白吸光度/β-actin吸光度的比值代表蛋白相對表達水平，實驗組survivin和livin的表達均低于對照組（P<0.01）。隨著冬凌草甲素濃度的升高，livin與survivin的表達逐漸降低，高濃度組表達survivin及livin水平最低（表1）。表明冬凌草甲素能抑制NCI-H460細胞中survivin和livin蛋白表達，其抑制作用與冬凌草甲素濃度相關。

4 討論

尋找有效的抗腫瘤藥物對于肺癌的治療具有極其重要的意義。冬凌草甲素是從冬凌草中提取出來的二萜類化合物，其分子式為C12H28O6，具有明顯的抗腫瘤活性，能夠抑制肝癌、胃癌、食管癌、黑色素瘤等多種腫瘤細胞的增殖，抑制核轉錄因子-KB（NF-KB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）[2]、表皮生長因子受體等相關信號通路，誘導腫瘤細胞的凋亡[3]。目前已有冬凌草甲素對肺癌細胞作用的報道，研究顯示冬凌草甲素能誘導A549細胞和SPCA-1的凋亡，但是冬凌草甲素誘導肺癌細胞凋亡機制尚未明確，需要進一步的實驗研究。

Livin和survivin是近年來發現的重要的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP），僅特異性的表達于腫瘤和胚胎組織中。兩者都含有抑制caspase蛋白酶的結構域，在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。Survivin是目前發現的最強的凋亡抑制因子，在食管癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌等腫瘤細胞中高表達，可以與caspase-9直接結合或與輔助性線粒體源性caspase激活因子結合間接抑制caspase活性而抗凋亡。Livin是最近發現的一種新的IAP，在食管癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌等腫瘤細胞中高表達。Livin與caspase結合后，可以阻止caspase蛋白執行蛋白切除功能，從而抑制細胞凋亡。

本研究中發現，冬凌草甲素作用于NCI-H460細胞后，細胞發生凋亡，經冬凌草甲素干預的NCI-H460細胞livin和survivin蛋白表達明顯降低，表明冬凌草甲素誘導細胞凋亡的作用與livin和survivin表達下調有關。

本課題通過體外研究，表明冬凌草甲素能誘導NCI-H460肺癌細胞的凋亡，并抑制NCI-H460肺癌細胞表達livin和survivin，為冬凌草甲素用于肺癌治療提供理論依據。

參考文獻：

[1]車憲平，韓瑞發，肖進逐，等.冬凌草甲素和冬凌草多糖膀胱灌注治療C57BL/6小鼠膀胱腫瘤的療效及機制[J].中國病理生理雜志，2010，26(7):1410-1412.

[2]Bu HQ， Luo J， Chen H， et al. Oridonin enhances antitumor activity of gemcitabine in pancreatic cancer through MAPK-p38 signaling pathway[J]. Int J Oncol， 2012，41(3):949-958.

[3]Gao FH， Liu F， Wei W， et al. Oridonin induces apoptosis and senescence by increasing hydrogen peroxide andglutathione depletion in colorectal cancer cells[J]. Int J Mol Med， 2012， 29(4):649-655.

編輯/孫杰