抗氧化劑在缺血再灌注損傷中對大鼠腸粘膜的保護作用

摘要：目的 探討預先腸道給予抗氧化劑對大鼠腸缺血再灌注損傷小腸粘膜的保護作用。方法 使用75只成年雄性SD大鼠，采用生理鹽水、維生素C、維生素E和后兩者的組合進行實驗干預。依據腸血管供應游離腸管，通過夾閉供應該段腸管的血管進行缺血再灌注造模。在未夾閉、缺血末期及再灌注期每15min取材。分時段取材后進行定量、定性分析。結果 與其他組比較，使用維生素E組和維生素E、維生素C聯合組呈顯著衰減缺血再灌注損傷作用。最后研究表明以上兩組與控制組和維生素C組比較，能顯著的減少絨毛高度的降低及中性粒細胞的浸潤。結論 在缺血再灌注實驗模型中，維生素E做前期處理能夠減弱I/R對大鼠小腸粘膜的損傷，減少絨毛高度的降低、衰減中性粒細胞的浸潤。

關鍵詞：缺血；再灌注；再灌注損傷；抗氧化劑缺血組織血流量恢復會造成比原先缺血引起更大的損傷，這個過程稱為缺血再灌注（I/R）損傷。I/R時，小腸是最容易受損傷的。雖然所涉及的機制尚未完全闡明，但相信，氧化應激的炎癥介質發揮重要的作用。由于超氧化物（ROS）參與I/R損傷的發生，多種抗氧化劑都進行過研究，其中就包括維生素C、維生素E。維生素C是一種水溶性、還原性的抗氧化劑，常被用來對抗I/R造成的損傷。維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，通過穩定細胞膜的不飽和脂肪酸的來對抗氧化應激反應。因此，維生素E能減少組織ROS反應，增加組織抵抗膜質過氧化的作用，維生素C、E聯合應用有協同效應。本研究的目的是用維生素C、E前期處理實驗大鼠，通過空腸的形態標準來評估其對I/R小腸粘膜的積極作用。

1資料與方法

1.1空腸缺血再灌注模型使用75只體重介于224~261g的成年健康雄性SD大鼠，腹腔注射氯胺酮麻醉后剖腹探查。游離腸系膜動、靜脈，長度足夠放置血管夾即可。以游離動脈供應的腸段作為取材部位。在未夾閉血管前取材一次（BC）。為了避免其他因素影響小腸絨毛的高度，達到徹底地模型效應，游離腸段3cm左右，并切斷所有的側支循環。夾閉腸管血管1h后，進行第2次取材（BI），后移去血管夾，恢復血流，分別在再灌注15min（RB15）、30min（RB30）、45min（RB45）和60min的（RB60）取材。

1.2實驗分組75只大鼠隨機分為5組：T組大鼠行剖腹探查并切除選定腸管，不做缺血再灌注損傷模型。對照組行剖腹探查術，并行腸管缺血再灌注造模，預定時間點取材，沒有預先處理。C組造模，術前4d通過喂養的方式給予250mg/kg維生素C。E組也造模，術前4d與C組相同的方式給予60mg/kg維生素E。C+E組行與對照組相同的手術，并喂養與C組、E組相同計量的兩種藥物。

1.3損傷的指標用定量分析方法來評估缺血再灌注的損傷。腸管損傷程度用組織切片絨毛的高度、中性粒細胞浸潤的程度來評價。為減小誤差及偏倚，所有標本由本實驗室被雙盲的技術人員用Chiu等人提出的分類標準進行評估。使用光學顯微鏡在10個隨機鏡頭視野統計絨毛的高度分布，單位為毫米（mm）。通過在20個隨機域內中性粒細胞浸潤數量來評估評價其浸潤、損傷程度。

1.4 統計學分析數據采用（x±s）表示。采用Spearman and Pearson檢測評估變量之間的相關性。多因素比較采用方差分析（ANOVA）。P值< 0.05為有統計學意義。

2結果

2.1 絨毛高度 數據顯示隨時間絨毛的高度逐漸降低（表2）。整體比較發現取材點與絨毛高度有統計學上顯著的相關性。見表1。

在每一組不同的時間點、不同組的相同時間段內進行絨毛高度的比較。首先，在對照組，絨毛的高度從BC的（363.55±35.89）減少到RB60的（129.16±27.17），具有統計學意義（P<0.001）。與RB15比較也是有顯著性差異的，RB15的絨毛高度為（296.87±46.13），P=0.004（表2）。在C組，相同的是，與RB15的比較有顯著性差異（P<0.001）。E組的絨毛平均高度從BC的（343.93±46.79）減少到RB60的（154.12±31.88）（P<0.001），與BI的比較有顯著性差異P<0.001（表2）。使用與E組相同的方式比較同時使用維生素C+E的大鼠組，平均腸絨毛的高度從BC的（332.37±48.96）減少到RB60的（156.23±29.63）（P<0.001），并且與B1的比較有統計學意義P<0.001（表2）。在相同的取材時間點中，回腸平均絨毛高度從對照組的（363.55±35.89）到E+C組的（332.37±42.00）沒有統計學意義（P=0.235，表2）。在B1時，當對照組（338.53±45.08）與E組（249.00±35.34，P<0.001）和C+E組（240.07±44.26）比較時，有顯著的差異，P<0.001。在RB15，對照組（296.87±46.13）和C+E組（230.99±46.38）之比有統計學意義，P= 0.029。在RB30，C+E組與對照組有顯著差異（P<0.001），在RB45，與C+E組（P=0.020）和E組（P=0.037）這種差異仍然存在，在RB60，與E組為P=0.032、C+E組為P=0.025。見表2。

2.2中性粒細胞浸潤再灌注期間，中性粒細胞浸潤的數量呈進行性增加（表3）。依據不同的時間段及處理，對中性粒細胞在黏膜、黏膜下層浸潤的數量進行比較，取材的時間段與中性粒細胞浸潤數量之間有顯著的相關性。見表3。

在所有的分組中，中性粒細胞數量都是遞增的。對于RB30，這種增長在對照組與E組之間有統計學意義。在C組與C+E組做比較時，RB15點有統計學意義（表2）。在BI、BC，各組之間無統計學意義。在RB15、RB30，當C組、C+E組與E組及對照組比較時有統計學意義(表4)。在RB45，各組之間無統計學意義（P=0.2087）。在RB60，C組、E組和C+E組之間有統計學意義（表4）。

3討論

維生素C因其抗氧化作用被廣泛用于缺血再灌注損傷中。一項使用維生素C的兔子實驗研究，證明其與甘露醇、N-乙酰半胱氨酸能改善腸系膜動脈血流。但是在小腸微觀結構中只有維生素C、甘露醇有直接的保護作用，顯著減少缺血再灌注損傷 。另一項研究評估維生素E的抗氧化作用，通過測量腸黏膜丙二醛、谷胱甘肽的含量，將其作為定性的病理評分。它表明維生素C和甘露醇有黏膜保護作用，減少胃黏膜的損傷及丙二醛的積累。然而，在維生素E的使用上，在這些檢測數據并沒有差異。據此作者認為，由于維生素C和甘露醇的有效性和易用性可能有助于預防腸道的缺血再灌注損傷。這兩篇都使用維生素C靜脈注射，顯示出其適當的保護作用。在我們的研究中，我們可以找出在定量上的顯著性差異。有學者的研究結果表明，在手術缺血階段的維生素C能促進鐵誘導的脂質氧化損傷。在治療劑量方面，較小劑量的維生素C因為增加炎癥反應而在治療缺血再灌注損傷上有負面影響。在血清、粘膜的檢測中證明使用維生素C防止脂質過氧化是無效的。

在缺血前使用維生素E表現出對I / R損傷大鼠肝臟生化、組織病理的保護作用。術前用藥也被證明是一種有效減少再灌注損傷的方法。有臨床研究，外科手術前靜脈注射維生素E顯著降低肝缺血再灌注損傷，具有良好的安全性，并減少血液肝相關酶的濃度、縮短ICU停留時間。在人體內，維生素C、維生素E降低氧化應激的反應。心肌梗死的患者，再灌注后維生素E的水平顯著下降，而再灌注失敗的患者不出現。對于血清中的維生素C水平，這兩種情況下沒有什么區別。維生素E的消耗證明心肌梗死后心肌處在再灌注階段，這是心肌梗死再灌注的標志性指標。

在再灌注期間粘膜中的中性粒細胞浸潤的數量增加，并與腸道損傷相平行。維生素C、E都證實能降低肺I/R損傷，但不能防止發生，因為它們抑制中性粒細胞的激活，但不能抑制其他來源的活性氧化物的生產。在大鼠回腸，聯合使用維生素C、E表現出良好的效應，增加腸管的活性。在這項研究中，E組和C+ E組有較高的絨毛高度、較少的中性粒細胞浸潤，表明粘膜損傷與中性粒細胞浸潤的密切相關性。

在本研究中，再灌注期，絨毛高度逐步減少、中性粒細胞浸潤增加，而且給予維生素E或維生素C+E能減輕粘膜損傷有重要意義。在我們的研究中，一項重要的意義就是在個分組中觀察中性粒細胞的浸潤，同樣是不同的實驗處理得到不同的浸潤程度。在再灌注的后期，E組與C+E組腸粘膜內中性粒細胞的浸潤明顯減少。

據上分析推斷：術前給予維生素E等還原性活性物，能夠減輕大鼠小腸粘膜缺血再灌注損傷。這種術前處理安全又簡單易行。實驗中證明單獨使用維生素C沒有明顯的積極意義。

參考文獻：

[1]Petra F， Drowatzky J， Boengler K， Finckh B， Schmitz KJ， de Groot H. Protection from glycine at low doses in ischemia-reperfusion injury of the rat small intestine[J].Eur Surg Res 2011;46(4):180-187.

[2]Bailey DM， Raman S， McEneny J， Young IS， Parham KL， Hullin DA， et al. Vitamin C prophylaxis promotes oxidative lipid damage during surgical ischemia-reperfusion[J].Free Radic Biol Med 2006;40(4):591-600.編輯/哈濤