薄層色譜自顯影法分離檢測海洋放線菌T-2-3中抑菌成分

摘要：目的采用薄層色譜生物自顯影方法對北極海洋放線菌T-2-3提取物的抑菌成分進行研究。方法采用大孔樹脂對該放線菌活性成分進行富集，并針對活性成分進行薄層生物自顯影檢測。結果經檢測，Rf 0.40的點為活性化合物。結論薄層色譜生物自顯影法是一種快速分離檢測抑菌成分的實驗手段。

關鍵詞：薄層色譜生物自顯影；海洋放線菌；抑菌活性

Detcetion of Antimicrobial Components from the Marine Actinomycetes T-2-3 by TLC Bioautography

MI Hui-wen， LU Yuan-yuan， XING Ying-ying，XI Tao

(Department of Marine Pharmacy， School of Life Science Technology， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，Jiangsu，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the antimicrobial components in extracts of Arctic Marine actinomycetes T-2-3 by TLC bioautography. MethodsThe active fraction was extracted by macroporous resin， and detected by TLC bioautography. ResultsThe compoud of Rf 0.40 behave antimicrobial activity. ConclusionTLC bioautography is a fast method to isolate and detect antimicrobial activity components.

Key words：TLC bioautography; Marine actinomycetes; Antimicrobial activity海洋微生物由于其特殊的生存環境，表現出特異的代謝方式，同時可以產生結構新穎且具有特殊生物活性的化合物，是海洋生物活性物質的重要來源[1]。目前為止，已知有22000多種微生物次級代謝產物中70%由放線菌產生，而10000多種抗生素由鏈霉菌屬產生[2]。鏈霉菌屬在放線菌中占有重要的地位，是生物活性物質的重要來源。

薄層色譜生物自顯影法（TLC-Bioautography）是近年來應用的一種集分離、生物活性和鑒定于一體的\"化合物+生物活性\"的測定方法[3-4]。本實驗室前期從北極海底海泥沉積物中分離得到一株海洋放線菌T-2-3，經初步鑒定為鏈霉菌屬。本實驗利用TLC-生物自顯影法對T-2-3的提取物中的抗菌活性成分進行檢測，為進一步分離純化活性成分提供了依據。

1資料與方法

1.1一般資料 噻唑藍(MTT)購自Sigma公司；替加環素、氨芐西林購自美國Amresco公司。所用試劑均為市售分析純。

1.2方法

1.2.1 T-2-3菌株粗提物樣品制備 將生長良好的T-2-3斜面培養物接種至種子培養基中，180 r/min搖床，28 ℃培養3 d；然后轉接于發酵培養基中，180 r/min搖床，28℃下持續發酵5 d，收取發酵液，并用D-101大孔樹脂富集，依次用水，100%乙醇梯度洗脫，洗脫部位減壓濃縮得浸膏，將乙醇梯度的浸膏用甲醇溶解，制備成 20 mg/mL供試樣品。

1.2.2供試菌及其培養 供試細菌：①革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃八疊球菌；②革蘭氏陰性菌：大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌；③臨床耐藥菌：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）3株、耐甲氧西林表皮葡萄球菌3株、肺炎克雷伯桿菌3株、鮑曼不動桿菌3株。以上菌株由中國藥科大學海洋藥物研究中心提供。

細菌及臨床耐藥菌的培養：挑取單菌落接到100 mL LB液體培養基中，37℃，過夜培養，菌液稀釋至106 CFU/mL，待用。

1.2.3打孔擴散法檢測提取物的抑菌活性 提取物用甲醇溶解配成濃度為2 mg/mL的溶液，作為檢測樣品。將氨芐西林、替加環素配成100 μg/mL的溶液，分別為陽性對照。將LB瓊脂（含量為2%）培養基倒入培養皿中，厚度約為4 mm，待其冷卻凝固。然后，取200 μL指示菌種子液用涂布棒均勻涂布，用打孔器（Ф=6 mm）在培養基上打孔，每皿4個孔，每孔加藥100 μL，分別為空白對照、陰性對照、陽性對照、樣品，37℃下培養18~22 h后，觀察結果，測量抑菌圈直徑。

1.2.4提取物的薄層層析 將甲醇溶解的提取物采用毛細管點樣，點樣量為5 μL，點樣直徑<3 mm。預先用展開劑（氯仿：甲醇=7∶4）飽和層析缸，5 min后將硅膠板放入層析缸，進行線性上行展開，當展開劑至硅膠板上端1 cm處，取出并用鉛筆標記溶劑前沿，揮干溶劑，然后用5%硫酸-乙醇噴霧，100℃下加熱顯色5 min。

1.2.5生物自顯影 將展開的薄層板在超凈工作臺上紫外殺菌30 min。將含有2%瓊脂的LB培養基，以涂布法涂加指示菌，即先將溫度為40℃~50℃的LB瓊脂培養基涂加到薄層板上，待培養基凝固后，在薄層板上涂加200 μL的指示菌種子液，將薄層板放在濕室內37 ℃培養12 h，取出薄層板，在上面噴加外源顯色劑噻唑藍（MTT），約10 min后，即可觀察結果。有抑菌成分處，指示菌由于受到抑菌成分的抑制而出現抑菌斑；無抑菌成分處，指示菌正常生長，通過MTT顯色出現藍色背景色，與抑菌斑區分開[5]。

2結果與分析

2.1打孔擴散法對抑菌成分的檢測 提取物對多種G+、G-細菌及多種臨床耐藥菌有明顯的抑制活性，見表1、表2，其中對G+的抑制活性明顯強于G-及多種臨床耐藥菌。

2.1.1提取物對細菌的抑制活性，見表1，抑制圈表示為（x±s）。

2.1.2提取物對臨床耐藥菌的抑制活性，見表2。

2.2 TLC-生物自顯影法對抑菌成分的檢測 采用TLC-生物自顯影法初步檢測了樣品對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及MRSA的抑制活性，見圖1。結果顯示，薄層板上有兩個明顯的點J1、J2，Rf值分別為0.67、0.40，其中J2顯示為活性點，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及MRSA分別有不同程度的抑制活性。

圖1 TLC-生物自顯影檢測放線菌T-2-3提取物中抑菌活性成分

注：A：5%硫酸-乙醇加熱顯色；B、C、D分別為樣品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、MRSA的抑菌效果。

3討論

海洋特殊生態環境中的生命資源已成為拓展天然藥用資源的新空間，也是目前資源最豐富、保存最完整、最具新藥開發潛力的新領域[6]。TLC-生物自顯影法可在普通實驗室條件下進行，操作簡單，結果直觀，重復性好，靈敏度高，已廣泛用于多種生物活性物質如抗菌劑、酶抑制劑、抗氧化劑的篩選。本文在TLC-生物自顯影的基礎上結合MTT比色法，檢測了北極海洋放線菌T-2-3提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及MRSA的抑菌成分，并根據活性成分的極性大小，為活性成分的進一步分離純化提供依據。

參考文獻：

[1]黃永中，羅雄明，王建華.海洋沉積物來源鏈霉菌屬次生代謝產物及其生物活性研究進展[J].天然產物研究與開發，Nat Prod Res Dev，2011，23:758-766.

[2]Fenical，W，Jensen，PR. Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria[J].Nat. Chem. Biol 2006，2:666-673.

[3]Anwesa B，Subir KB，Nishith KP，et al，In vitro antibacterial potential of Eugenia Jambolana seed extracts against multidrug-resistant human bacterial pathogens[J].Microbiological Research， 2012，167:352-357.

[4]楊成，熊延靖，劉輝.薄層色譜-自顯影技術分離檢測石榴皮清除自由基活性成分[J].皖南醫學院學報，2011，30(4):270-272.

[5]趙江林，徐利劍，黃永富，等.TLC-生物自顯影-MTT法檢測滇重樓內生真菌中抗菌活性成分[J].天然產物研究與開發Nat Prod Res Dev 2008，20(51):28-32.

[6]史清文，李力更，王于方.海洋天然產物研究與新藥開發[J].藥物評價研究，2011，3(33):165-174.

編輯/肖慧