HPLC法測定歸芪補血口服液中黃芪甲苷的含量

摘要：在臨床中，通過等度洗脫的高效液相色譜法，對歸芪補血口服液中所含的微量物質黃芪甲苷的含量進行測定，在測試中，經過對不同的樣品進行檢測和對比，確立起了最好的提取條件以及檢測條件。這樣的方法十分的簡便容易操作，測量的精密度和準確度都是十分值得參考的，具有很好的穩定性，回收率也比較高，所以能夠作為測定歸芪補血口服液中黃芪甲苷提供方法的依據。

關鍵詞：高效液相色譜法；歸芪補血口服液；黃芪甲苷；提取隨著我國醫藥事業的發展，在我國很多的常見藥物中，有很多時具有營養機制和抗氧化價值的，其藥理活性和藥用價值都是十分值得研究的，這些藥物在我們的實際生活中跟人體健康密切相關。黃芪中富含有很多的黃芪皂苷、黃酮等化合物，這些化合物自身有十分強的生物活性，歸芪補血口服液能夠用在治療細胞免疫功能低下的慢性肝炎，也可以用于慢性活動性肝炎，在臨床中治療的效果十分的有效。不僅如此，歸芪補血口服液還可以用來治療白細胞減少癥及和血小板減少性紫癜。在對蒙古黃芪中的皂苷類和黃酮類有效成分的相關的研究和探索中發現，皂苷類成分擁有14個共有峰，而黃酮類成分則具有12個共有峰[1-3]，這些數據說明這些成分的化學成分是十分復雜的，那么對有效物質的提取和檢測的要求就會變的很高。

1材料與儀器

試劑：95％乙醇；無水乙醇；氯仿；正丁醇；丙酮；無水乙醚；鹽酸；碳酸鋇；乙酸酐。上述所有的劑都是分析純。儀器：UV-2401P紫外分光光度儀，TG328B光電分析天平；CKQ-250DE型數控超聲波清洗器。Gilentlloo高效液相色譜儀；HH-S2系列恒溫水浴鍋；FTIR一8400S型紅外光譜儀；GSP-84-02型磁力恒溫攪拌器，上述儀器都是由島津公司生產。

2檢測的方法與取得的結果

2.1對黃芪甲苷的提取歸芪補血口服液50ml加入6倍體積量(V／V)的60％乙醇，NaOH飽和溶液調節pH至12，溫度：調節至60°，通過加熱回流提取2次，最終得到提取液200ml，之后通過減壓濃縮獲取到濃縮液約100ml。通過重復的濃縮液萃取，最終得到黃芪甲苷粗品約25.0mg，通過HPLC檢測純度超過80％。之后再次進行反相硅膠C-18常壓色譜柱分離，并通過60％甲醇洗脫，最終獲得黃芪甲苷純品約13.5mg，在實際的檢測中HPLC檢測純度符合藥典標準。詳細的數據可以參照具體HPLC圖與主峰含量，附件為圖1與表1。經過掃描的結果顯示，黃芪甲苷在325nm處顯示出的波長處吸收最強，這時其靈敏度較高。將峰面積積分值為縱坐標，而將對照品濃度為橫坐標，以橫縱坐標為標準，繪制標準曲線。得到回歸方程：黃芪甲苷Y=13.614X-1.4897，r=0.9999。線性范圍為10.2-102ug／mL。

圖1黃芪甲苷純品HPLC色譜圖

2.2相關樣本的準備工作在檢測中，把3份樣品放置在20ml的容量瓶中，這三份樣品具有不同的生產日期，并且都經過了抽提，將提取液大約15ml浸泡，在室溫條件下，放置大約4h，放置后通過超聲提取30min，在進行了過濾后，將得到的濾液于物理蒸干溶劑，對過濾的殘渣用6 mL甲醇一甲酸進行溶解，之后放置在固定容量為5ml的容器瓶中，將溫度調至4°以下進行保存，等待檢測。

2.3測量的精密度和測量準確度提取混合對照品溶液20 mL，對樣品溶液進行HPLC檢測，檢測過程中連續進樣6次，然后得到黃芪甲苷面積的相對標準偏差分別為0.59％，檢測結果顯示出該方法測量的精度十分準確。從已知精密度的黃芪甲苷樣品中，取三份樣品，通過樣品來準備跟處理方法制備計算回收率，經過計算得知結果分別為95.9％、94.5％和95.0％，通過這組數據可以得知，這樣的測量收率高。

2.4進行穩定性試驗將3份樣品通過制備方法制備溶液后，然后進行0h，1d，2d，3d時的進樣測定，通過檢測得到的結果顯示，3份樣品溶液在3d范圍內，都能保證性質的基本穩定。

2.5對含量的測定分別通過精密的儀器西區3份黃芪甲苷樣品的提取液20mL，然后進樣，對測定的結果數據進行記錄。

3討論

本研究所測定的黃芪甲苷屬于黃芪制劑當中的一種主要的活性成，它在臨床上已經得到證實，具有抗炎降壓的功效，也有鎮痛鎮靜的功能。近年來，許多學者通過現代藥理學發現，黃芪甲苷一方面可以改善及優化白細胞的變形能力，另一方面可以改善提高心肌收縮與舒張的功能，也可以提升胰島素在機體中的分泌能力，及清除機體自由基等。目前黃芪制劑中黃芪甲苷含量測定方法有比色法、TLCS法、HPLC法等[4-8]。

比色法利用了黃芪甲苷跟顯色劑可以發生特殊的顯色反應從而生成某類有色的物質，使它可以運用可見分光光度儀來測定。一般常見的顯色劑為香草醛--硫酸與香草醛-高氯酸等。常常是使用香草醛-硫酸比色法對黃芪甲苷進行測定。這種方法主要是采用在濃H2SO4這種介質中，使黃芪甲苷的酚羥基跟香草醛醛基實發生醛縮合的反應。把需要測定的樣品通過乙醇給予溶解以后，然后加入適量的香草醛液及硫酸液，一般對其加熱約 15min，接著放在 578nm處進行吸收度的測定。此方法可以說操作比較簡便，發生反應的靈敏度也比較高，實驗結果重現性比較好。

TLCS法(薄層掃描法)又稱原位定量薄層色譜掃描法（QTLC）系指用一定的波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點或經照射能激發產生熒光斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品定性定量的分析方法。這種方法大部分是運用雙波長掃描的方法，以消除其中的有機成分之干擾與操作誤差，進而提高靈敏度與準確度，可分為內標法與外標法。齊瑗晶等測定了催乳顆粒劑中黃芪甲苷的含量。實驗中樣品用氫氧化鉀液提取除去酸性成分，以正丁醇萃取使背景干擾少，用大孔樹脂分離皂苷除去樣品中糖類等水溶性雜質，并在層析缸中放一小杯氨水，使斑點分離明顯；加樣回收率為97.39%。此方法使用不簡便、干擾因素多、準確度低、重復性不好。

HPLC法 是以液體作為流動相，并采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術。

因其分離度好、靈敏性高，適用范圍廣等優點，已廣泛用于黃芪甲苷的含量測定、穩定性、藥理和臨床研究中。高效液相色譜法應用于藥物含量的測定在藥物分析中是主要的一個方面，是一種集分離和測定為一體的分析方法，主要的特點是：專一性強，靈敏，快速簡便。

由此可見，對黃芪甲苷的分析方法中，大部分制劑因為成分比較復雜，容易受到外界的干擾，而HPLC 法與 TLCS 法則操作比較簡單、可以快速、高效地測定出結果，因此這2種方法是比較好的選擇[9-14]。

綜上所述，在當前的醫學發展中，黃芪甲苷的測定方法主要有傳統的薄層色譜法(TLC)、毛細管電泳法(CZE)等，然而這些傳統的方法在世界的測定中，都沒有很好的靈敏度以及重復性。通過這樣的實驗，建立了測定歸芪補血口服液中黃芪甲苷的HPLC法，再通過采用反相硅膠C-18常壓色譜柱分離，使用60％甲醇洗脫，實驗中對檢測波長進行選擇的時候，是通過流動相為溶劑稀釋的對照品來進行的，實驗中采用的紫外分光光度法在200~400的掃描吸收光譜，實驗的數據顯示黃芪甲苷在325 nm處有吸收量和靈敏度都達到最高峰，所以故選定325 nm為檢測波長。而實驗中最佳提取條件為：區6倍于注射體積的乙醇，保持提取溫度為60°，pH值為12。試驗中發現，HPLC法供試品溶液制備試驗中，用三氯甲烷萃取歸芪補血口服液及用60％甲醇洗脫固體小柱，均能去掉大部分雜峰，使黃苠甲苷有效峰與雜峰能有效的分離。通過具體的實驗可以得知HPLC法操作簡便迅速，而實驗的效果和穩定性都比較好，這一方法能夠作為歸芪補血口服液中黃芪甲苷物質提供方法依據。

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編輯/哈濤