HPLC法測定馬來酸依那普利的含量

摘要：目的 建立HPLC法測定馬來酸依那普利含量的檢測方法。方法 采用Kromasil 100-5C18(150×4.0mm)色譜柱，流動相為磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調pH至2.2）-乙腈（75:25），檢測波長：215nm，流速：1.0ml/min，柱溫：50℃，進樣量：20μl。結果 馬來酸依那普利的在濃度為0.12mg/ml~0.28mg/ml的范圍內與峰面積呈良好的線性關系(r=0.9998)，回收率（n=9）為100.1%，RSD為0.4%。結論 該方法專屬性強，重復性好，測定結果準確，可靠，可用于馬來酸依那普利的含量測定的質量控制。

關鍵詞：HPLC；馬來酸依那普利；含量測定隨著社會的發展，物質生活水平的提高，工作節奏的加快以及人們在生活飲食方面的不注意和工作壓力等各方面原因，使得高血壓成為一種高發病。高血壓患病率隨著年齡的增長呈明顯上升趨勢，即60歲及以上老年人有50%為高血壓患者。但近年來年輕人群患病率的增加趨勢比老年人更明顯，使得高血壓具有年輕化趨勢。高血壓是世界最常見的心血管疾病，也是最大的流行病之一，常引起心、腦、腎等臟器的并發癥，嚴重危害著人類的健康，因此提高對高血壓病的認識，對早期預防、及時治療有極其重要的意義。馬來酸依那普利是第二代血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI)，既能有效降低血壓，又能減少尿白蛋白排泄量(UAE)，對二腎型高血壓、一腎型高血壓及自發性高血壓均有明顯降壓作用，對合并外周動脈病變有較好的療效，是治療高原性高血壓測首選要藥。其制劑馬來酸依那普利片、馬來酸依那普利膠囊是治療高原性抗血壓藥，而作為其唯一原料藥的馬來酸依那普利的中國藥典質量標準中僅采用高氯酸滴定法測定其含量。本文采用HPLC法測定其含量，該方法方法重復性好，專屬性強，測定結果準確，可靠，可用于馬來酸依那普利的含量測定的質量控制。

1儀器與試藥

1.1試藥馬來酸依那普利原料藥批號為5113-13-001、5113-13-005、5113-13-009由浙江華海藥業股份有限公司提供；馬來酸由浙江華海藥業股份有限公司提供，依那普利拉對照品批號：100707-200401，馬來酸依那普利對照品批號：100705-200401，依那普利雙酮對照品，批號：100706-200401，由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2試劑水是二次純化水，乙腈是色譜級，其他試劑均為分析純。

1.3試驗儀器Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent1100色譜工作站，紫外可變檢測器，AE240雙量程電子天平，ZRS-8G智能藥物溶出儀等。

2色譜條件

色譜柱:Kromasil 100-C8(150×4.6nm); 流動相: 磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調pH至2.2）-乙腈（75:25）；流速1.0ml/min；檢測波長：215nm；柱溫：50℃；進樣量20μl。

3測定方法

3.1含量測定供試品溶液的制備：精密稱量馬來酸依那普利10mg，置于50ml量瓶中，加水適量，超聲溶解，在加水稀釋至刻度，搖勻，即可。

對照品溶液的制備：精密稱量馬來酸依那普利對照品40mg，置于50ml量瓶中，加水適量，超聲溶解，在加水稀釋至刻度，搖勻，即可，得對照品儲備液。精密移取對照品儲備液5ml，置20ml量瓶中，加水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密取對照品溶液和供試品溶液各20μl注入液相色譜儀，在215nm處測定峰面積，記錄色譜圖。

3.2方法專屬性分別取溶劑（水）、流動相、\"3.1\"項下馬來酸依那普利供試品溶液、馬來酸依那普利對照品溶液各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。色譜圖見圖1~圖4結果表明，在相同的檢測條件下，溶劑、流動相、對馬來酸依那普利的檢測均無干擾。（圖中1-馬來酸，2-依那普利）。

圖1-溶劑（水）

圖2-流動相

圖3-對照品 圖-4樣品圖

圖5-系統適應性圖譜

3.3系統適用性的考察系統適用性溶液配制：用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，稱取馬來酸適量，加流動相超聲溶解并制成每1ml含馬來酸0.5mg的溶液；另分別取馬來酸依那普利對照品、依那普利拉對照品、依那普利雙酮對照品溶液適量，加流動相超聲溶解成每1ml中含0.2mg的溶液，再精密移取1ml到10ml容量瓶中，加流動相稀釋到刻度，搖勻，得混合溶液。取馬來酸溶液和混合溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，在215nm處測定峰面積，記錄色譜圖。依那普利峰拖尾因子應小于2.0，馬來酸峰與依那普利拉峰的分離度應符合要求，依那普利拉，依那普利與依那普利雙酮各峰之間的分離度應大于4.0。色譜圖見圖5 （1-馬來酸，2-依那普利拉，3-依那普利，4-依那普利雙酮）。

3.4線性關系的考察分別精密移取\"3.1\"項下對照品儲備液3ml、4ml、5ml、6ml、7ml置5個20ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件將以上對照品溶液分別進樣20μl，以濃度（C，mg/ml）橫坐標，峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y=2E+07x+172959r=0.9998結果表明，馬來酸依那普利在0.12mg/ml~0.28mg/ml濃度范圍內線性關系良好。

3.5定量限和檢測限測定取線性范圍內某一濃度逐級稀釋至一定濃度，在相應的波長下連續進樣3次進行檢測，取某一段基線，使信燥比為S/N=10:1為檢測定量限，使信燥比為S/N=3:1為最小檢測限，結果依那普利的檢測定量限為0.384ug/ml，最小檢測限為0.115ug/ml。

3.6精密度試驗取\"3.1\"項下對照品溶液，精密吸取20ul注入液相色譜儀測定，連續進樣6次，測定峰面積，測得依那普利峰面積的RSD（n=6）為0.07%。結果表明該方法精密度良好。

3.7重復性試驗取\"3.1\"項下供試品溶液，精密吸取20ul注入液相色譜儀測定，連續進樣6次，測定峰面積，計算含量，結果依那普利的平均含量為97.6%，RSD（n=6）為0.7%。表明方法的重復性良好。

3.8加樣回收率試驗分別精密稱定已知含量的馬來酸依那普利4mg、5mg、6mg各3份分別置于50ml①量瓶中，再精密稱量馬來酸依那普利對照品50mg置于50ml量瓶中，加水超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密移取4、5、6ml各3份依次對應移入上述①中，用水配制成相當于含量測定的80%、100%、120%濃度的溶液各3份。再精密稱取馬來酸依那普利對照品10mg，置于50ml量瓶中，加水超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液，按含量項下方法測定，記錄色譜圖，以外標法計算低、中、高3個濃度的的回收率（n=3）分別為100.3%、（RSD=0.33%），100.15%（RSD=0.32%），99.85%（RSD=0.41%）；平均回收率（n=9）為100.1%，RSD為0.4%。

3.9溶液的穩定性取\"3.1\"項下供試品溶液1份，于室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12h時取20μl注入液相色譜儀在，在12h內含量測定結果平均值為97.7%，RSD為0.1%，表明供試品溶液在室溫下放置12h內的是穩定的。

3.10色譜條件變化分別使用正常流動相，預定測試不同比例的流動相（緩沖液-乙腈比例分別為75-25；78-22；70-30）以及不同的柱流速（mL/min）分別為0.8、1.0、1.2，待儀器系統穩定后測試系統適用性溶液。結果馬來酸與依那普利拉的分離度4.5、4.1、3.7；5.6、5.0、5.1；2.7、2.5、2.3；依那普利拉與依那普利的分離度7.7、6.9、6.3；8.9、8.0、7.5；5.9、5.4、4.9依那普利與依那普利雙酮分離度19.6、19.1、18.3；20.1、19.6、20.3；19.5、18.6、17.6。由數據可知，小的色譜條件的變動，各峰的分離度變化量不大，系統適用性試驗符合要求，可以確定小的色譜條件變動，不會影響到含量的測定結果。

3.11含量測定結果按已經建立好的測定方法測定原料馬來酸依那普利3批樣品中依那普利的含量，批號為5113-13-001、5113-13-005、5113-13-009結果分別為99.3%、99.8%、99.6%。

4討論

4.1流動相的選擇文獻3中采用甲醇-乙腈-水-1%磷酸（60:5:33.5:1.5）為流動相測定馬來酸依那普利的含量；而2010年《中國藥典》二部，采用HPLC法對馬來酸依那普利的有關物質及其制劑的有關物質和含量進行測定時均采用流動相為磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調pH至2.2）-乙腈（75:25），兩種流動相相比較后，藥典標準所使用的流動相中試劑較少，減少對環境的污染，且能使樣品中各峰很好的分離，所以參照2010年《中國藥典》二部標準采用此流動相為馬來酸依那普利含量測定的流動相，并用該流動相對馬來酸依那普利的含量測定展開方法學實驗的研究。

4.2 HPLC測定的選擇2010版《中國藥典》二部采用冰醋酸和無水二氧六環微溫溶解后，加結晶紫指示液后，用高氯酸滴定液滴定來測定馬來酸依那普利的含量，在操作的過程中，冰醋酸易受溫度的影響，在微溫時易揮發，這樣會使樣品溶解不全；而高氯酸滴定液易受溫度，濕度的影響，在放置的過程中受到環境中溫度、濕度的影響，易使高氯酸滴定液的F值發生變化，使測定的結果出現較大的偏差；在滴定的結果中的顯色要求達到純藍色即可，由于每個人對顏色的判斷不同，并且操作的手法不同，都易使測定結果的準確度降低。2010年《中國藥典》二部，采用HPLC法對馬來酸依那普利的有關物質及其制劑的有關物質和含量進行測定，參照法定標準液采用HPLC法來測定馬來酸依那普利的含量。本實驗采用HPLC法測定馬來酸依那普利的含量，簡便，快速，結果準確，重復性良好。

4.3檢測波長的選擇取馬來酸依那普利和馬來酸依那普利對照品適量，用水溶解稀釋至適當的濃度，照紫外-可見分光光度法（中國藥典2010 年版二部附錄IV A）。在200nm～400nm波長掃描，對照品溶液和樣品溶液在215 nm處有最大吸收。再分別將溶劑（水）和流動相也在200nm～400nm波長掃描，溶劑、流動相在 215nm處均無吸收，在此波長處對馬來酸依那普利的測定沒有干擾，故選擇215nm作為馬來酸依那普利含量測定的檢測波長。

4.4依那普利為堿性物質，常與馬來酸成鹽供臨床應用，馬來酸在紫外-可見分光光度法200nm～400nm波長掃描的215nm處也有吸收，采用磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調pH至2.2）-乙腈（75:25）為流動相HPLC法測定能使馬來酸與依那普利更好的分離。在依那普利主要降解為依那普利拉和依那普利雙酮哌嗪，依那普利拉為活性二酸代謝物，在堿性物質存在及較高溫度下長時間干燥會使依那普利進一步降解為依那普利拉和依那普利雙酮哌嗪。依那普利拉和依那普利雙酮的存在會引起咳嗽這一副作用，所以必須嚴格的控制這兩者的含量。2010年《中國藥典》二部中已采用HPLC法對馬來酸依那普利的有關物質進行測定，并控制了有關物質的限度，故本法中不在對其有關物質進行研究。

參考文獻

參考文獻：

[1]馬來酸依那普利，馬來酸依那普利片，馬來酸依那普利膠囊.中國藥典[S]，2010年版，二部，2010：45-47.

[2]藥品質量標準分析方法驗證指導原則.中國藥典[S].2010年版， 2010，（附錄）:194.

[3]余琛，張慧，洪有采，等.反相高效液相色譜法測定馬來酸依那普利的含量[J].藥物分析雜志，1996，06:29-31.

編輯/哈濤