板藍(lán)根美拉德反應(yīng)對(duì)MDCK細(xì)胞保護(hù)作用的研究

摘要：目的 通過不同處理的板藍(lán)根樣品對(duì)MDCK細(xì)胞的保護(hù)作用來分析板藍(lán)根加工處理過程中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs）的抗病毒作用。方法 將不同加工處理的板藍(lán)根樣品加于MDCK細(xì)胞，然后接種病毒液，72h后用MTT法于570 nm處測(cè)定OD值，并計(jì)算保護(hù)率。結(jié)果 7th樣品對(duì)MDCK細(xì)胞受流感病毒侵染有顯著的保護(hù)作用，而鮮根、生藥、2nd對(duì)流感病毒侵染無明顯阻斷作用，且其在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出毒害作用。結(jié)論 板藍(lán)根樣品對(duì)病毒是否有阻斷作用，一方面可能取決于樣品加工過程中產(chǎn)生MRPs的量和種類，另一方面可能與板藍(lán)根樣品的加工處理方式相關(guān)。

關(guān)鍵詞：板藍(lán)根；美拉德反應(yīng)；抗病毒

Study on Protection of MDCK Cells with Different Ways of Processing of Radix Isatidis extract

WANG Ke-jing1，2，HAN Jian1

(1.Pathogen Biology Research Institute，Basic Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730000，Gansu，China;2.Department of Endocrinology，General Hospital of Lanzhou Military Area Command，Lanzhou 730000，Gansu，China)

Abstract：ObjectiveInvestigate the antiviral effect of Different Radix Isatidis samples to the protection for MDCK cells， study the pharmacological effects of MRPs in the process of Radix Isatidis. MethodsAdd the different Radix Isatidis samples in MDCK cells， and then vaccination disease venom， Measuring the OD value by MTT method at 570 nm after 72 h， and calculate the recovery. Results 7th samples has significant protection on MDCK cells of the influenza virus infection， but fresh root， crude drugs and 2nd have no obvious effect， And showed toxic on cell in a certain concentration range. ConclusionIf there is a blocking effect on the influenza virus infection of Radix Isatidis samples， first may depend on the sample type and quantity of MRPs， second may be associated with the processing methods of Radix Isatidis samples.

Key words：Radix Isatidis; Maillard Reaction; antiviral

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，板藍(lán)根具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及增強(qiáng)免疫力等作用[1，2]，被廣泛應(yīng)用于治療諸如流感、發(fā)熱、乙肝、腮腺炎等疾病，臨床療效確切。然而中藥區(qū)別于其他藥物的顯著特點(diǎn)是其藥效與炮制、制劑過程密切相關(guān)，中藥湯劑中黑褐色物質(zhì)是其在炮制、煎煮等熱加工過程中產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard Reaction Products，MRPs）[3]，是不同種類的中藥在這些加工過程中最主要的、共同新生物質(zhì)[4]。韓立坤等[5]確認(rèn)紅參炮制過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)，李向高等[6]測(cè)定精氨酸雙糖甙含量在紅參中比生曬參高3倍，并據(jù)此提出控制美拉德反應(yīng)條件對(duì)提高紅參加工質(zhì)量有重要意義。本研究旨在確證板藍(lán)根在不同加工條件下的美拉德反應(yīng)對(duì)其體外抗病毒作用的影響，并分析其可能的作用機(jī)理，亦為中藥熱加工過程產(chǎn)生的MRPs是中藥湯劑中的重要藥效成份的假說提供有力的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料流感病毒（H1N1亞甲型病毒）由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室提供；狗腎上皮細(xì)胞（MDCK）由蘭州軍區(qū)總院實(shí)驗(yàn)中心保存；板藍(lán)根采購于甘肅省定西市板藍(lán)根GAP生產(chǎn)基地。

MEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；小牛血清購自HyClone公司；MTT購自美國AMRESCO公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)用板藍(lán)根提取液的制備鮮根提取液和生藥提取液的制備：分別稱取粉碎后板藍(lán)根鮮根和生藥各35g，于100mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中充分浸潤(rùn)，并于4℃攪拌浸提過夜，然后21400g離心15min，收集上清液，即為鮮根樣品和生藥樣品提取液；板藍(lán)根孵育樣品的制備：各稱取板藍(lán)根生藥50g于60℃，85%濕度下孵育2d與7d（下文簡(jiǎn)稱2nd、7th），加入8倍量水，沸水煎煮2次，第1次2h，第2次1h，過濾并合并煎液，21400g離心15min，取上清液定容至155mL，即為2nd、7th樣品提取液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)操作將MDCK細(xì)胞用胰酶消化并混勻，稀釋至2.5×105個(gè)細(xì)胞/mL，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加200μL/孔細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h至MDCK細(xì)胞鋪滿孔底，用無菌PBS洗掉細(xì)胞表面的小牛血清蛋白。將稀釋好的各濃度樣品加于已長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的96孔板內(nèi)，每濃度4孔，200μL/孔，37℃ 3h后棄樣品液，加100 TCID50病毒液100μL，同時(shí)各加100μL的細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng) 2h后棄病毒液，加細(xì)胞維持液200μL，于37℃、5%CO2 培養(yǎng)。72h后用MTT法于570nm處測(cè)OD值。保護(hù)率計(jì)算公式為：保護(hù)率%=（OD570樣品組- OD570病毒組/OD570對(duì)照組- OD570病毒組）×100%。

2結(jié)果

2.1板藍(lán)根鮮根對(duì)MDCK細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)板藍(lán)根鮮根提取液通過保護(hù)細(xì)胞而起到抗病毒效果的結(jié)果如圖1所示，不同濃度鮮根提取液細(xì)胞組存活率均低于病毒對(duì)照組，說明鮮根提取液與細(xì)胞作用后，對(duì)病毒侵染MDCK細(xì)胞不僅沒有保護(hù)作用，反而表現(xiàn)出一定程度的毒害作用，但各濃度對(duì)MDCK細(xì)胞毒害的差異不明顯。

圖1板藍(lán)根鮮根提取液對(duì)MDCK的保護(hù)作用

2.2板藍(lán)根生藥對(duì)MDCK細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)板藍(lán)根生藥提取液對(duì)MDCK細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。當(dāng)生藥濃度為20mg干物質(zhì)/mL時(shí)，其對(duì)MDCK細(xì)胞的保護(hù)率為5.7%。當(dāng)?shù)陀诖藵舛葧r(shí)，其對(duì)細(xì)胞不但沒有保護(hù)作用，反而有一定的毒害作用，但各濃度對(duì)MDCK細(xì)胞毒害作用差異不顯著。

圖2板藍(lán)根生藥對(duì)MDCK細(xì)胞的保護(hù)作用

2.3板藍(lán)根2nd樣品對(duì)MDCK細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)板藍(lán)根2nd提取液對(duì)MDCK細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。各濃度2nd樣品與鮮根提取液一樣，對(duì)MDCK細(xì)胞均沒有保護(hù)效果。在病毒侵染細(xì)胞情況下，甚至表現(xiàn)出不同程度的毒性作用，樣品濃度越稀，其對(duì)細(xì)胞的毒害作用越大，但最后亦趨于穩(wěn)定。

圖3板藍(lán)根2nd樣品對(duì)MDCK細(xì)胞的保護(hù)作用

2.4板藍(lán)根7th樣品對(duì)MDCK細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)板藍(lán)根7th提取液通過保護(hù)細(xì)胞而起到抗病毒效果的結(jié)果見圖4。由圖可知，7th樣品提取液對(duì)MDCK細(xì)胞有較好的保護(hù)效果。當(dāng)樣品濃度為31.5mg干物質(zhì)/mL時(shí)，其對(duì)MDCK細(xì)胞的保護(hù)率為40.76%，說明7th樣品在適當(dāng)濃度下，可阻攔病毒侵染細(xì)胞。隨著樣品濃度的降低，其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果逐漸減弱，說明隨著樣品稀釋倍數(shù)的增大，7th樣品中可保護(hù)細(xì)胞的有效成分減少，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果亦下降。

圖4板藍(lán)根7th樣品對(duì)MDCK細(xì)胞的保護(hù)作用

3討論

藥物體外對(duì)抗流感病毒受多種因素的影響，如樣品的處理和加工、質(zhì)量、產(chǎn)地、濃度等。本實(shí)驗(yàn)通過不同處理的板藍(lán)根樣品對(duì)MDCK細(xì)胞的保護(hù)作用來考察鮮根、生藥、2nd、7th樣品的抗病毒效果。實(shí)驗(yàn)中先加板藍(lán)根各樣品提取液后接種病毒的目的是為了觀察板藍(lán)根樣品能否進(jìn)入細(xì)胞或者吸附于細(xì)胞表面以阻止病毒的吸附和進(jìn)入。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7th樣品對(duì)MDCK細(xì)胞受流感病毒侵染有顯著的保護(hù)作用，而鮮根、生藥、2nd對(duì)流感病毒侵染無明顯阻斷作用，且其在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出毒害作用。說明7th樣品中的MRPs可與細(xì)胞膜結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制了病毒血凝素HA與MDCK細(xì)胞膜唾液酸受體的結(jié)合，或是樣品中MRPs與膜的結(jié)合使得HA結(jié)合位點(diǎn)附近的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其空間位阻增大，從而保護(hù)了MDCK細(xì)胞受病毒的侵染。

實(shí)驗(yàn)樣品同為板藍(lán)根，卻對(duì)病毒表現(xiàn)出不同的阻斷效果，究其原因，可能是因?yàn)榘逅{(lán)根不同加工方式使得美拉德反應(yīng)產(chǎn)生MRPs量及種類不同[ ]。因此，板藍(lán)根樣品對(duì)病毒是否有阻斷作用，一方面可能取決于樣品加工過程中產(chǎn)生MRPs的量和種類，另一方面可能與板藍(lán)根樣品加工處理得當(dāng)與否相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論對(duì)改善板藍(lán)根加工炮制方法具有一定的參考意義。

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編輯/哈濤