甲醛復(fù)制小鼠輸卵管炎性不孕癥動(dòng)物模型的研究

摘要：目的通過(guò)向小鼠輸卵管注入適量甲醛，復(fù)制炎性不孕動(dòng)物模型。方法成熟雌性KM小鼠隨機(jī)分對(duì)照組、細(xì)菌感染組、高劑量甲醛組、中劑量甲醛組和低劑量甲醛組(每組15只)，分別向輸卵管內(nèi)注入生理鹽水、混合菌液、3%甲醛、2%甲醛和1.5%甲醛各0.02 mL(左右各0.01 mL)，10 d后與成熟公鼠3∶1晚20∶00合籠，次日晨8∶00觀察有陰道栓判為受孕，未孕鼠則繼續(xù)合籠，連續(xù)3 d后統(tǒng)計(jì)受孕率。每組再隨機(jī)取5只小鼠脫臼處死，觀察輸卵管大體解剖并取組織用10%甲醛固定作病理切片H.E.染色觀察。結(jié)果高、中、低劑量甲醛組小鼠受孕率均顯著低于對(duì)照組（均P<0.01），而與細(xì)菌感染組無(wú)顯著差異（均P>0.05）。高、中、低劑量甲醛組和細(xì)菌感染組肉眼觀可見(jiàn)輸卵管有不同程度僵硬、積水或積膿，輸卵管與周?chē)M織有不同程度粘連；切片鏡下觀可見(jiàn)輸卵管腫脹增厚，黏膜皺褶明顯減少，全層可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論輸卵管內(nèi)注入適量甲醛可成功復(fù)制小鼠輸卵管炎性不孕動(dòng)物模型。

關(guān)鍵詞：甲醛；輸卵管炎；不孕癥；動(dòng)物模型；小鼠

據(jù)資料顯示，由于輸卵管因素所致的不孕占不孕癥的30%～50%，其中非特異性慢性輸卵管炎又占輸卵管因素的50%[1]，可見(jiàn)慢性輸卵管炎是女性不孕癥的重要原因之一。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)向小鼠輸卵管內(nèi)注射適量甲醛溶液，探索復(fù)制輸卵管炎性不孕動(dòng)物模型，為人類(lèi)輸卵管炎性不孕的研究提供疾病動(dòng)物模型。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1動(dòng)物 清潔級(jí)成年育齡雌性KM(昆明)種小鼠75只，體重28～32 g，隨機(jī)分為生理鹽水組、高劑量甲醛組、中劑量甲醛組、低劑量甲醛組和細(xì)菌感染組，每組各15只；成熟雄性小鼠25只，體重32～36 g，均由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物號(hào)SCXK2009-0002）。

1.1.2細(xì)菌 菌種由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室培養(yǎng)和提供，以大腸埃希菌、金葡菌、鏈球菌按2∶1∶1比例用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān)涑蓾舛燃s為3×109/mL混合菌。

1.1.3儀器 光學(xué)顯微鏡：OlympusCX41奧林巴斯顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.2方法 用一次性黃色塑料移液管剪去適量末端自制小鼠\"擴(kuò)陰器\"以將雌性小鼠的陰道撐開(kāi)，然后將注射器針頭緩緩插入子宮體腔，分別在兩側(cè)輸卵管的開(kāi)口處進(jìn)針，向輸卵管到卵巢方向緩慢注射；為防止注射液返流回子宮腔，注射時(shí)小鼠的頭位朝下，陰道口朝上，并且在注入液體稍滯留片刻后再慢慢將針頭拔出，防止液體倒流。高劑量甲醛組、中劑量甲醛組、低劑量甲醛組分別注射用無(wú)菌生理鹽水配制的3%、2%、1.5%的甲醛溶液0.02 mL（左右側(cè)輸卵管各注入0.01 mL）；方法同上，細(xì)菌感染組則注入現(xiàn)配好的細(xì)菌混懸液0.02 mL，生理鹽水組則注入無(wú)菌生理鹽水0.02 mL。

1.5合籠配種 造模后第10 d，各組雌鼠與成熟公鼠按3∶1于晚上20∶00關(guān)燈合籠過(guò)夜，次日晨8∶00檢查，陰道口有陰道栓者判為已孕，無(wú)陰道栓為未孕。未孕雌鼠則繼續(xù)合籠同上，連續(xù)3 d，最后統(tǒng)計(jì)各組小鼠受孕率，公式：受孕率=(組內(nèi)受孕鼠數(shù)/組內(nèi)配種雌鼠總數(shù))×100%。

1.6形態(tài)學(xué)觀察 配種結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)抽取5只雌鼠脫臼處死，剖腹觀察輸卵管大體病理學(xué)改變，包括輸卵管形狀、色澤改變情況，與周?chē)M織有無(wú)粘連，是否增粗或變細(xì)，彈性變化，以及有無(wú)積水、化膿等。然后各取小塊組織用10%中性甲醛溶液固定，作常規(guī)病理切片和H.E.染色，光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組受孕率比較采用χ2檢驗(yàn)，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1小鼠受孕情況 受孕情況，見(jiàn)表1。

2.2一般情況和大體病理 實(shí)驗(yàn)中，高、中、低劑量甲醛組小鼠因嚴(yán)重感染分別死亡了2只、3只、1只，皆死于術(shù)后1 w內(nèi)。生理鹽水組小鼠剖腹可見(jiàn)輸卵管外觀粗細(xì)均勻、光滑圓潤(rùn)，色澤紅潤(rùn)，富有彈性，與周?chē)M織無(wú)粘連，無(wú)積水或化膿現(xiàn)象。與生理鹽水組比較，高、中、低劑量甲醛組和細(xì)菌組小鼠輸卵管均見(jiàn)到不同程度色澤蒼白，明顯變細(xì)，粗糙，彈性差，脆而易損，與周?chē)M織或多或少有粘連，個(gè)別輸卵管及其周?chē)M織可見(jiàn)積水或積膿。

2.3光鏡觀察病理學(xué)改變 常規(guī)切片H.E染色鏡下觀可見(jiàn)生理鹽水組小鼠輸卵管管壁組織結(jié)構(gòu)清晰，管腔通暢，黏膜上皮呈柱狀，有纖毛，見(jiàn)圖1:a，f。高劑量甲醛組、中劑量甲醛組、低劑量甲醛組和細(xì)菌感染組小鼠輸卵管管壁結(jié)構(gòu)分界不清晰，管腔變窄甚至阻塞，纖維組織明顯增生，血管擴(kuò)張充血，全層可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及少量酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1:b，c，d，e，g，h。

圖1 甲醛處置對(duì)小鼠輸卵管內(nèi)膜的影響

3討論

在小鼠，輸卵管是胚胎種植處，任何影響輸卵管生理功能的因素均可能導(dǎo)致不孕。研究表明，人類(lèi)輸卵管及小鼠輸卵管病理上出現(xiàn)炎癥滲出、積水、積膿、粘連，以及產(chǎn)生纖維疤痕、管壁變硬、增厚，可導(dǎo)致輸卵管或輸卵管狹窄、阻塞，妨礙受精或種植可造成不孕[2-3]。

有關(guān)生殖道炎癥復(fù)制不孕動(dòng)物模型，國(guó)內(nèi)徐桂中[3]等用金黃色葡萄球菌制作小鼠慢性輸卵管性不孕模型；黃河玲[4]等用苯酚膠漿劑注射制作兔子慢性輸卵管炎模型；李祥云[5]等用β溶血性鏈球菌制作兔子輸卵管阻塞模型；劉麗[6]等用混合菌金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌等制作大鼠輸卵管不孕模型。國(guó)外，Pearlman MD等用大腸桿菌制作家兔不孕動(dòng)物模型[7]，Patton DL等則用衣原體復(fù)制猴的不孕動(dòng)物模型[8]。但對(duì)于小鼠用甲醛損傷輸卵管造成炎癥從而復(fù)制不孕動(dòng)物模型尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用自制\"擴(kuò)陰器\"在非麻醉狀態(tài)下進(jìn)行輸卵管甲醛注射，對(duì)小鼠創(chuàng)傷小，操作簡(jiǎn)便并易于推廣；再者，造成的炎癥效果和細(xì)菌制作輸卵管炎癥模型相似，不孕情況相近。故我們認(rèn)為通過(guò)輸卵管注入適量甲醛損傷輸卵管致炎性損傷，是一種簡(jiǎn)便易行的不孕動(dòng)物模型制作方法。

參考文獻(xiàn)：

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[6]劉麗，谷娜，張軼群，等.解毒除濕化瘀止痛法對(duì)輸卵管炎性阻塞性不孕大鼠模型作用機(jī)理的研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，5（2）:117-119.

[7]Pearlman MD，McNeeley SG，F(xiàn)rank TS，et al.Antiendotoxin antibody is protective against tubal damage in an Escherichia coli rabbit salpingitis model[J].Am J Obstet Gynecol，1997，171(6):1588-1593.

[8]Patton DL，Sweney YT，Kuo CC.Demonstration of delayed hypersensitivity in Chlamydia trachomaits salpingitis in monkeys:a pathogenic mechanism of tubal damage[J].J Infect Dis，1994，169(3):680-683.編輯/肖慧