超氧化物歧化酶在Hcy誘導的THP—1單核細胞源性巨噬細胞中的抗氧化作用

摘要：目的 探討超氧化物歧化酶（SOD）在Hcy誘導的THP-1單核細胞源性巨噬細胞氧化應激中的作用。方法 THP-1單核細胞，加入佛波酯（PMA）誘導分化為巨噬細胞，然后加入100μmol·L-1的 Hcy 和100μmol·L-1 Hcy+葉酸+VB12，并設置對照組（0μM Hcy），孵育48h后收集細胞。采用Fe3+還原比色法檢測總抗氧化能力（T-AOC）、黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性及硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量。結果 100μmol·L-1 Hcy組與對照組比較，T-AOC、SOD水平明顯降低，MDA的含量明顯升高；與100μmol·L-1Hcy+葉酸+VB12組比較，T-AOC、SOD水平升高，MDA的含量降低。結論 Hcy可誘發THP-1單核源性巨噬細胞發生氧化應激，SOD的活性下降且與MDA呈負相關，表明SOD在Hcy誘導的THP-1單核細胞源性巨噬細胞中的抗氧化作用下降。

關鍵詞：超氧化物歧化酶；同型半胱氨酸；THP-1單核細胞源性巨噬細胞；氧化應激；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化（AS）是一種多因素誘導的慢性炎癥性疾病，在其眾多的致病因素中，氧化所致的損傷與AS的發生發展密切相關。同型半胱氨酸（Hcy）已被大量臨床及循證醫學證實是AS的一個重要的獨立危險因子，Hcy致AS的確切機制仍然有待闡明，目前多數學者認為與Hcy致氧化應激毒性損傷有關。正常情況下，隨著氧化代謝效率的提高，體內的抗氧化能力也不斷增強，人體已經形成較為完善的抗氧化體系，即機體和細胞內活性氧的生成和清除處于一種動態平衡，當在某些因素的作用下這種平衡被打破，就形成了氧化應激。在機體抗氧化機制的研究中，超氧化物歧化酶（SOD）作用的發現具有重要意義。SOD催化超氧陰離子自由基的歧化反應，作為氧自由基清除的第一反應過程，在阻止自由基和脂質過氧化對機體的損害方面起關鍵性作用。因此，本研究通過體外培養THP-1單核細胞源性巨噬細胞，探討SOD在Hcy誘導的THP-1單核細胞源性巨噬細胞氧化損傷中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料 THP-1單核細胞株來源于四川大學華西醫學院；RPMI-1640培養基為GIBCO 公司產品；小牛血清，胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料研究所；同型半胱氨酸（Hcy）、葉酸、維生素B12、佛波酯（PMA）為Sigma公司產品；總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；BCA蛋白含量檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2方法

1.2.1單核細胞培養 將復蘇好的THP-1單核細胞接種于15%胎牛血清的RPMI 1640 培養液中，于37℃、5% CO2的培養箱中靜置培養，傳代。以4×106密度接種于25cm×25cm培養瓶，加入PMA使其終濃度為500μmol·L-1（含7%胎牛血清）孵育48h，顯微鏡下觀察細胞呈貼壁狀態，證實THP-1細胞已誘導分化為巨噬細胞。

1.2.2實驗分組 當貼壁的THP-1巨噬細胞密度達到1×106/mL時分別加入100μmol·L-1的 Hcy 和100μmol·L-1 Hcy +葉酸+VB12，并設置對照組（0μM Hcy），孵育48h后檢測氧化應激指標。

1.2.3培養細胞的收集、破碎及蛋白濃度的測定 用橡皮刮子刮下孵育后的THP-1巨噬細胞，1000rpm/min，離心10min棄上清，1mlPBS輕輕吹打，再次1000rpm/min，離心10min棄上清，重懸于0.5ml緩沖液中。功率300W，冰水浴，每3～5s超聲一次，間隔4次。上述樣本用凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度，用于計算。

1.2.4氧化應激指標測定 總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）等指標均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行測定。

1.2.5統計學處理 用Prism 5.0統計軟件進行統計學分析，結果以x±s表示，組間兩兩比較用Student-Newman-Keuls檢驗，兩樣本均數間比較采用Student's t 檢驗，多樣本均數間比較采用One-way ANOVA檢驗，P<0.05有統計學意義。

2結果

2.1單核細胞誘導前后形態學變化 THP-1單核細胞懸浮生長，細胞呈圓形，透亮，大小均一，形態規則，胞膜完整見（圖1）。經PMA誘導48h后，在倒置顯微鏡下觀察，細胞呈貼壁狀態，由圓形變為有偽足的不規則形狀的巨噬細胞見（圖2）。

圖1 THP-1單核細胞（400×） 圖2 THP-1巨噬細胞（400×）

2.2 THP-1單核細胞源性巨噬細胞T-AOC、SOD及MDA水平改變 THP-1巨噬細胞分別用100μmol·L-1的 Hcy 和100μmol·L-1 Hcy+葉酸+VB12干預，檢測各組細胞中T-AOC、SOD及MDA的水平（圖3）。結果顯示，100μmol·L-1Hcy組與對照組比較T-AOC、SOD水平顯著降低（P<0.05），MDA的含量顯著升高（P<0.05），有統計學意義；與100μmol·L-1 Hcy + 葉酸+VB12組比較，T-AOC、SOD水平升高，MDA的含量降低，但無統計學意義。

圖3 Hcy干預THP-1單核細胞源性巨噬細胞T-AOC、SOD及MDA的含量

3討論

Hcy是一類含硫氨基酸，為體內蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的一個重要中間產物，在具有AS早期病變的患者中30%患者有高Hcy（HHcy）血癥，HHcy血癥致動脈粥樣硬化的病理機制涉及多個環節[1]，其中促進超氧化物和過氧化物的產生，加重體內脂質過氧化程度所致的損傷不容忽視。大量基礎及臨床研究認為，氧自由基參與了心血管疾病發生、發展。SOD是人體內重要的抗氧化活性物質，它可以清除人體代謝中不斷產生的自由基，保護機體組織免受自由基和過氧化損傷。在各種氧自由基中，活性氧對血管毒性最大，脂質過氧化終產物丙二醛（MDA）被認為是氧化應激的標志物。Cavalca[2]等亦發現氧化應激在冠心病中明顯加強，而且游離MDA在不穩定型和穩定型心絞痛患者間有明顯差別。本研究結果顯示：100μmol·L-1Hcy組的T-AOC、SOD水平明顯降低，MDA的含量明顯升高，抗氧化系統酶活力下降，巨噬細胞抗氧化能力減弱，提示Hcy促進THP-1巨噬細胞發生氧化應激可能是其導致動脈粥樣硬化的機制之一。此外，本研究還發現：100μmol·L-1 Hcy+葉酸+VB12組，與100μmol·L-1Hcy組比較，T-AOC、SOD水平升高，MDA的含量降低，說明葉酸和VitB12在Hcy誘導的THP-1單核細胞源性巨噬細胞氧化損傷中的有拮抗作用，這與相關的臨床研究及動物實驗一致。文獻報道[3，4]葉酸、VB12干預可降低血漿Hcy濃度，減少動脈SMTI，可改善HHcy導致的氧化應激狀態。因此，適量葉酸、VB12具有一定程度的抗HHcy導致AS的作用，但尚需有待進一步研究。

總之，THP-1單核源性巨噬細胞在Hcy的作用下，SOD的活性下降且和MDA呈負相關，表明SOD保護作用下降，脂質氧化損傷程度增加。反之，則說明SOD能夠在一定范圍內清除由Hcy刺激THP-1單核細胞源性巨噬細胞所產生的氧化物質，從而降低細胞的氧化損傷，為預防和治療AS提供新的作用靶點。

參考文獻：

[1]Graham M， Daly LE， Refsum HM， et al. Plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease[J].JAMA，1997；277（22）；1775-81.

[2]Cavalca V， Cighetti G， Bamonti F. Oxidative stress and homocysteine in coronary artery disease[J]. Clin Chem， 2001， 47（5）： 887-892.

[3]朱栓立，蘆海，喬華，等.高血壓病患者血漿同型半胱氨酸水平與動脈內膜厚度的相關性[J].中華心血管病雜志，2001，29（4）：197.

[4]Lee H， Kim JM， Kim HJ， et al.Folic acid supplementation can reduce the endothelial damage in rat brain microvasculature due to hyperhomocysteinemia[J].JNutr， 2005； 135（ 3）： 544-8.

編輯/申磊