年齡相關性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中骨連蛋白分析

摘要：目的 探討LECs中SPARC于年齡相關性白內(nèi)障晶狀體中的臨床表現(xiàn)，對比不同年齡白內(nèi)障晶狀體中SPARC的表達。方法 將108例白內(nèi)障患者按照年齡分組，利用常規(guī)蛋白印跡法檢測各組白內(nèi)障LECs中SPARC含量，并對比研究。結果 白內(nèi)障患者年齡大的一組，其LECs中的SPARC表達增加，并且SPARC的表達隨著年齡的增長，表達愈來愈強烈。結論 SPARC在人體白內(nèi)障的發(fā)病過程中可能起到一定的作用，并且白內(nèi)障患者的晶狀體LECs中SPARC與患者的年齡相關。

關鍵詞：年齡相關性；對比研究； SPARC LECs

晶狀體上皮細胞（LECs' short of Lens Epithelial Cells）對白內(nèi)障發(fā)病密切相關，在白內(nèi)障的發(fā)病機理中具有重要意義，這與其結構與功能的變化決定晶狀體（Crystalline lens）透明狀況。骨連蛋白（SPARC）是由多細胞分泌形成的小分子蛋白[1]，于人體中表達活躍，并有研究結果表明白內(nèi)障發(fā)病與SPARC含量增加有關。本文分組對108例白內(nèi)障患者的LECs中SPARC含量進行對比研究，并將其分成正常對照組、氧化損傷組和熱應激處理組，分析SPARC在不同年齡白內(nèi)障中的致病機理，以及探討其在白內(nèi)障的發(fā)病過程中起到的作用，并且分析其中的致病機理。

1 資料與方法

1.1一般資料 以本院108例白內(nèi)障超聲乳化手術患者的晶狀體前囊膜作為實驗研究材料，108例患者中有男性56例，女性52例，年齡36～82歲；所用實驗試劑為羊抗人SPARC單克隆抗體（美國Santa cluz 公司）、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、胎牛血清（美國Gibco公司）；所用儀器為ThermoMLLtiskanMK3酶標儀、CO2培養(yǎng)箱、低溫高速離心機、JIM-X電泳儀、凝膠自動成像分析儀、GIS-700D型凝膠圖像系統(tǒng)。永生化人LECs系SRA01/04由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供。

1.2方法

1.2.1樣本采集 對照組材料來自12例正常人角膜晶狀體前囊膜，在晶狀體的赤道部，剪開前囊然后取出囊膜。實驗組為白內(nèi)障手術患者108例，根據(jù)年齡段分成4組（<48歲、48～64歲、65～78歲、>78歲年齡段組各27例），超聲乳化手術后取5mm直徑晶狀體前囊膜放入低溫冰箱中保存。在實驗前把每組的囊膜集合放一起，合并后每組一共5例，臨床上分為皮質型。

1.2.2細胞樣本 采用人LECsSRA01/04傳代培養(yǎng)樣本并將其分成正常對照組、氧化損傷組和熱應激處理組。細胞中加入200*106mol/LH2O2作用6 h；熱應激處理組： 42e30min， 37e恢復2 h。

1.2.3檢測SPARC含量 利用常規(guī)蛋白印跡法檢測各組白內(nèi)障LECs中SPARC含量：把細胞樣本囊膜剪碎并放入200μL裂解液中進行超聲粉碎，接著進行4℃、12000r/m in離心30min。BCA法定蛋白，對制成蛋白進行凝膠電泳[2]。電泳后將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，經(jīng)過50min后，把膜放入3%BSA封閉12h。把BSA液體倒掉后加入1：500一抗進行孵育，1h之后用TBS洗膜，重復三次，然后加入BCIP/NBT顯色劑顯色。接著用GIS-700D型凝膠圖像系統(tǒng)掃描分析，記錄分析實驗數(shù)據(jù)[3]。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件對本實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。本次實驗的數(shù)據(jù)都服從正態(tài)分布，并且方差齊性檢測出方差齊。本次研究中，采用單因素方差分析進行不同年齡組的LECs中SPARC的平均灰度值的比較，采用SNK-q檢驗來對各組間平均灰度值的兩兩比較，結果有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。

2結果

2.1 組織樣本 對照組43000處都沒見明顯的條帶，而實驗組都有明確的SPARC表達（P < 0.05），由結果可知，SPARC的表達隨著年齡的增長，表達愈來愈強烈。各個實驗組中，>78歲年齡段組比其他三組的表達都更強烈（P< 0.01），65～78歲組比64歲一下兩組表達均增高（P < 0.01），48～64歲組比<48歲組增高，但是差異無統(tǒng)計學意義（P= 0.055）

2.2細胞樣本 對照組43000處都沒見明顯的條帶，氧化損傷組和熱應激處理組都能見到明顯的SPARC表達。在細胞樣本正常對照組未見明確的SPARC表達，但是在白內(nèi)障組中可見明顯的表達。

3 討論

體內(nèi)很多細胞均可分泌SPARC這種蛋白，所以LECs也有比較豐富的表達。SPARC的生物學功能很多，主要是抗增生、調節(jié)細胞和細胞外基質的作用、與細胞因子結合以及相互作用、對生長發(fā)育的影響以及對損傷愈合血管的發(fā)生有影響等。

早期研究中發(fā)現(xiàn)，SPARC是一種細胞周期抑制劑，能夠抑制細胞周期性分化，它的去粘附作用主要是由于局部粘連的溶解和肌動蛋白纖維的重組造成的[4]。基于SPARC的調節(jié)作用體現(xiàn)在調節(jié)細胞對細胞外環(huán)境的變化作用相應的表達，這種作用能夠影響生長因子，細胞外基質結構蛋白的表達。SPARC與PDGF、VEGF的結合，并且通過終止生長因子的相互作用，從而減低了分化生長的能力。近年來也有研究發(fā)現(xiàn)，SPARC的作用不僅僅上述這些，還有能夠促進膠原纖維形成的功能，也就是說SPARC有膠原分子伴侶的作用。

科學家研究發(fā)現(xiàn)[5]，在小白鼠的胚胎肝細胞中的SPARC的位點消除，沒有SPARC的小白鼠能夠正常的生長發(fā)育并且繁殖后代，但出生6個月后出現(xiàn)眼部疾病，主要表現(xiàn)在晶狀體囊膜破裂以及白內(nèi)障的形成。提示SPARC參與了白內(nèi)障的發(fā)生，本次試驗也證實了LECs中SPARC的表達較正常晶狀體表達有明確上調。在白內(nèi)障的形成過程中，氧化損傷和熱應激是兩個非常重要的影響因素，因為當晶狀體對外界產(chǎn)生了應激時，SPARC的表達效果才高。在臨床上也可以發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增大，白內(nèi)障患者的術后復發(fā)率較小，并且復發(fā)后的發(fā)病程度也有所減輕，所以這也可以考慮SPARC隨年齡增長高表達有一定的關系。但是這種蛋白通過那種通道和途徑來對人體產(chǎn)生作用，是否涉及到已知的信號傳導通路，還是其它未知的信號傳導通路，這在將來還需要進一步探討。

4 結論

本次試驗證實65歲以上患者LECs中SPARC表達明顯增高，并且患者年齡越高，表達也充分。鑒于LECs對老年人白內(nèi)障有密切關系，可以考慮預防和治療白內(nèi)障的用藥是針對抑制LECs增生、粘附的作用為主。

參考文獻：

[1] 林雯，謝茂松，徐國興，何青，鄭衛(wèi)東. 水通道蛋白-1在高糖培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞中的表達[J].眼科研究，2010.

[2] 陶丹，王雪梅，雷霍. 年齡相關性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中hTERT的活性表達[J]. 中國醫(yī)藥導報，2010 .

[3] 鄭廣瑛，梁圓圓，王倩. 年齡相關性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞的Smac、caspase-3表達及死亡方式[J]. 眼科研究，2010 .編輯/許言