新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的原代分離、培養與鑒定

摘要：目的 探究新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar typeⅡepithelial cell， AT-Ⅱ）的原代分離、培養及鑒定方法，建立體外細胞模型。方法 取SPF級新生Wistar大鼠肺臟，采用胰蛋白酶聯合膠原酶消化法分離AT-Ⅱ，免疫黏附法純化細胞，體外培養并進行傳代研究，透射電鏡鑒定細胞。結果 AT-Ⅱ細胞原代培養和傳代研究成功，細胞生長狀態良好。電鏡觀察到板層小體。結論 采用改良方法獲得的AT-Ⅱ細胞符合體外實驗要求，第24～72h內處于最佳生長狀態，是進行實驗研究的良好時間段。

關鍵詞：新生大鼠；肺泡Ⅱ型上皮細胞；原代培養；鑒定

肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar typeⅡepithelial cells，AT-Ⅱ）是肺泡上皮細胞的干細胞，又被稱為\"顆粒性肺泡細胞\"和\"分泌細胞\"，是一種多功能細胞。AT-Ⅱ除了能增殖成新的AT-Ⅱ細胞，還可分化為肺泡Ⅰ型上皮細胞（alveolar typeⅠepithelial cell，AT-Ⅰ）[1]。AT-Ⅰ和AT-Ⅱ共同組成肺泡上皮屏障。AT-Ⅱ約占肺泡細胞群的60%[2]，細胞形態為多角形、立方形或圓形，細胞質內有大量反差明顯的細小顆粒。應用AT-Ⅱ開展相應研究，對認識肺的正常生理功能和多種肺部疾病有重要意義。

原代培養、分離、純化可以排除其他肺組織細胞對AT-Ⅱ的影響[3]。有文獻報道AT-Ⅱ易變性、易分化，表型喪失快，基本不能傳代[2]。亦有文獻報道它具有無限增殖的潛能[4]。本次實驗在借鑒他人實驗方法的基礎上進行了簡化改良，順利進行了AT-Ⅱ的原代培養、分離、純化與鑒定，并進行傳代研究。

1 資料與方法

1.1實驗動物 SPF級新生24h內Wistar大鼠，由甘肅中醫學院科研試驗中心SPF級實驗室提供。

1.2實驗試劑 DMEM培養基、PBS緩沖液、胎牛血清、0.2%膠原酶、0.5%胰蛋白酶、10%水合氯醛、75%乙醇、IgG溶液、100U青霉素、100U鏈霉素、5%戊二醛。

1.3方法

1.3.1新生大鼠AT-Ⅱ細胞的原代分離 取SPF級新生24h內Wistar大鼠，借鑒張秋月[5]等的方法加以改良進行實驗操作。10%水合氯醛麻醉乳鼠（0.3ml/100g），放入75%乙醇消毒1min。在超凈臺內進行無菌操作，取出肺組織，將其置于盛有5ml預冷PBS的無菌培養皿中，去除氣管、支氣管和小血管等組織，吸棄液體和雜質，再用無菌PBS反復沖洗直至液體澄清，吸棄液體后用無菌手術剪將其剪成lmm3碎塊。將其轉移至10ml無菌離心管中，加入0.2%膠原酶6ml，置于37℃恒溫震蕩水浴箱內消化1h，再加入4ml0.5%胰蛋白酶消化30min，4℃條件1500r/min離心5min，棄上清。加10%胎牛血清的DMEM培養基5ml終止消化，吹打均勻，200目金屬濾網過濾細胞懸液，將細胞濃度調至（2～3）×106個/ml。

1.3.2 AT-Ⅱ細胞的純化 借鑒Dobbs[6]等采用的IgG吸附純化法對AT-Ⅱ細胞進行純化。將調整好濃度的AT-Ⅱ細胞懸液，轉移至事先制備好的用大鼠IgG包被的無菌培養皿中，置于37℃、5%CO2培養箱孵育90～120min，移出未黏附的細胞，4℃條件800r/min離心l0min，棄上清[6-7]。

1.3.3細胞培養 取細胞沉淀，用DMEM完全培養基（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素）重懸細胞于一次性無菌培養瓶中，調整細胞濃度為（2～3）×106個/ml，置于37℃，5%CO2孵箱內。培養24h后，移除未貼壁細胞，無菌PBS洗2次，用完全培養基進行細胞換液。在倒置相差顯微鏡下觀察不同培養時間后細胞的貼壁生長情況和形態特征變化。

1.3.4細胞鑒定 AT-Ⅱ的鑒定方法有多種，如透射電鏡、免疫組織化學、免疫熒光染色、堿性磷酸酶（AKP）染色鑒定等。電鏡下可清楚觀察到AT-Ⅱ胞質內的特征性板層小體（嗜鋨小體），是鑒定AT-Ⅱ的金標準[1]，故采用該法進行細胞鑒定。用0.25%胰酶消化細胞，胎牛血清終止消化，稍作吹打后1000r離心7min，棄上清，加0.5ml 5%戊二醛固定。制備為電鏡細胞標本，于透射電鏡下觀察。

2 結果

2.1細胞生長狀態 實驗結果表明：新生大鼠AT-Ⅱ細胞原代培養24～36h大量貼壁，呈島狀生長；36～48h，細胞平展呈多邊形或圓形，相互連接成細胞單層，胞質內有大量反差明顯的細小顆粒，細胞核明顯；48～72h，細胞大量增殖，是生長最旺盛、活力最強的時期；第4～5d，細胞形態逐漸拉長，變扁平，胞內顆粒逐漸減少；第6～7d，細胞特征難以清晰辨認。其生長過程經歷了增殖、停滯、凋亡 3 個時期，生化特性變化快，在24～72h內處于最佳生長狀態[8]。增殖期是進行體外實驗的良好時間段，故其研究應在初始培養 3d內進行[9]。

2.2 AT-Ⅱ細胞傳代情況 實驗結果顯示，該細胞原代培養4d左右適合傳代，且傳代細胞生長正常，已傳至第5代細胞未死亡。鏡下觀察發現傳代細胞存在特征性結構板層小體，但原本反差明顯的顆粒變小變淺，說明細胞的某些性質還是在改變。此外，還探究用傳代培養的AT-Ⅱ代替原代細胞進行實驗的可能性。

2.3鑒定結果 透射電鏡下觀察到AT-Ⅱ細胞質內有大量反差明顯的深色顆粒，為其特征性結構板層小體，呈同心圓結構。

3 討論

AT-Ⅱ是一種多功能干細胞，對維持肺泡結構和功能有重要意義，其損傷缺乏、異常增生分化與慢性阻塞性肺部疾病、肺纖維化和肺癌等疾病的發生發展有密切聯系[8]。其增殖、分化機制與肺發育不良相關疾病、新生兒呼吸窘迫綜合征等過程都有著密切聯系[9]。它可維持肺泡內外液體平衡，其缺乏與急性肺損傷后肺水腫關系密切[8]。還具有免疫調節作用。目前，對于AT-Ⅱ的研究是在肺纖維化及肺癌發病中較為活躍的課題[10]。

提取成年大鼠AT-Ⅱ的操作復雜，灌肺洗肺后才能進行消化分離[11]。提取胎鼠AT-Ⅱ需要剖宮取鼠，增加取材難度和時間，且會導致大鼠死亡而增加成本。新生大鼠成本最低，取材純度相對較高，故選用。

AT-Ⅱ的分離可采用多種酶消化法。其中彈性蛋白酶效果最佳，但因其昂貴不易推廣。胰酶經濟適用，常作為消化首選[10]。胰酶和膠原酶的聯合消化法也是文獻報道的常用方法，合適的酶濃度和消化時間至關重要[12]。本實驗采用聯合消化法，效果較好。AT-Ⅱ的純化方法很多，差速離心和免疫黏附法是高效分離和純化AT-Ⅱ的方法， 所得細胞產量大、純度高[13]。電鏡鑒定AT-Ⅱ是目前最好的方法。電鏡下可清楚觀察到胞質內的特征性板層小體及粗面內質網、高爾基體等細胞器，還可觀察體外培養細胞的分化程度[11]。

本實驗對AT-Ⅱ生長狀況的研究結果與文獻報道基本相符，細胞在培養第 24～72 h內處于最佳生長狀態[8]，是進行體外實驗的良好時間段。在培養第4～5d傳代效果佳。傳到第5代其生物學特性逐漸消失，有助于研究其凋亡機制。

綜上所述，本實驗采用新生大鼠取材并通過改良的酶聯合消化法分離、純化、培養AT-Ⅱ的方法可行，為AT-Ⅱ的體外研究提供了相關技術儲備。該體外細胞模型為研究多種肺部疾病的發生發展奠定了實驗基礎。

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編輯/哈濤