離子交換高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定HBA1C

摘要：目的 應(yīng)用離子交換高效液相色譜法（HPLC）對(duì)人全血糖化血紅蛋白A1C（HBA1C）的自動(dòng)化和準(zhǔn)確的測(cè)定。方法 應(yīng)用D-10糖化血紅蛋白臺(tái)式測(cè)定儀測(cè)定，EDTA抗凝靜脈全血被自動(dòng)稀釋后注入分析柱。儀器測(cè)定系統(tǒng)將預(yù)先編程設(shè)置的由低到高離子濃度的緩沖液注入系統(tǒng)，在這一過(guò)程中，血紅蛋白經(jīng)和分析柱中偶聯(lián)離子結(jié)合的程度大小達(dá)到分離，處理好的樣本自動(dòng)被注入分析通路，分離的血紅蛋白隨后在流經(jīng)光感測(cè)量計(jì)時(shí)，測(cè)量其在415nm的光吸收情況，D-10糖化血紅蛋白測(cè)定系統(tǒng)臨床數(shù)據(jù)處理軟件（CDM）將每次分析過(guò)程中收集到的數(shù)據(jù)還原。此間還要經(jīng)過(guò)兩個(gè)水平的計(jì)算。通過(guò)微積分計(jì)算得出分析結(jié)果和分析圖譜，面積計(jì)算使用了指數(shù)模式的高斯對(duì)數(shù)（EMG），這樣計(jì)算已經(jīng)排除了可變部分的血紅蛋白A1C和氨基甲酰血紅蛋白等干擾成分。D-10糖化血紅蛋白測(cè)定系統(tǒng)可人全血管中自動(dòng)吸取樣本，隨后進(jìn)行稀釋和分析，每個(gè)樣本3min內(nèi)可完成測(cè)定。結(jié)果 該法測(cè)定線性范圍3.9%～18.5%，批內(nèi)變異系數(shù)0.48%～0.81%，小于2%，批間變異系數(shù)1.65%～2.35%，小于5%。結(jié)論 該法簡(jiǎn)便、快速、精準(zhǔn)，適用于臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)HBA1C水平。

關(guān)鍵詞：HBA1C；離子交換高效液相色譜法；糖尿病；D-10糖化血紅蛋白全自動(dòng)分析儀

糖化血紅蛋白即血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖不可逆結(jié)合的產(chǎn)物，是血紅蛋白兩條β鏈N端頡氨酸與葡萄糖化合而成，其中以A1C為主。是反映2～3個(gè)月血糖水平的指標(biāo)，在臨床上已作為評(píng)估長(zhǎng)期血糖控制狀況的金標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)《中國(guó)2型糖尿病防治指南》的建議，在治療之初至少檢測(cè)1次/3個(gè)月，一旦達(dá)到治療目標(biāo)可復(fù)查1次/6個(gè)月。HBA1C已是臨床決定是否需要調(diào)整治療的重要依據(jù)。

以住由于HBA1C的檢測(cè)不夠標(biāo)準(zhǔn)化，故不推薦用于診斷糖尿病。近年，HBA1C的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)全球不斷完善，2011年WHO正式發(fā)布\"應(yīng)用糖化血紅蛋白診斷糖尿病\"的咨詢報(bào)告，推薦有條件的地方將HBA1C作為糖尿病的輔助診斷手段。《中國(guó)糖尿病防治指南》已將HBA1C做為診斷糖尿病的指標(biāo)之一。

本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HBA1C采用了IFCC/NGSP雙認(rèn)證HPLC方法，與DCCT曾使用的方法一致。無(wú)需患者空腹，可以任意時(shí)間采血，且不受短期飲食、運(yùn)動(dòng)等生活方式的影響，一些非糖因素影響HBA1C而引起的誤差少見(jiàn)，如血紅蛋白病。并已很好的應(yīng)用于臨床。

1 資料與方法

1.1設(shè)備 BIO-RAD公司生產(chǎn)的D-10糖化血紅蛋白全自動(dòng)分析儀。

1.2試劑 BIO-RAD公司提供的配套的HBA1C試劑。

1.3樣本的收集與保存 采靜脈血2ml，用EDTA抗凝。室溫可穩(wěn)定3d，2℃～8°C可保存7d。若標(biāo)本量不足2ml則需取5ul全血+1.5mlWash試劑然后放在帶有標(biāo)本條形碼的白色套內(nèi)。

1.4樣本處理 將樣本輕輕顛倒混勻，放置于專用樣品架插入軌道掃描待測(cè)。

1.5樣本分析 當(dāng)樣品管導(dǎo)入儀器后，取樣針直接穿透真空采血管的橡膠帽后再升起，讓空氣進(jìn)入樣品管從而避免管內(nèi)殘存的壓力導(dǎo)致吸樣不準(zhǔn)。取樣針吸入一定量的全血樣品到進(jìn)樣裝置內(nèi)，在稀釋單元進(jìn)行樣本溶血與稀釋。稀釋好的已經(jīng)溶血的樣品，由高壓泵注入離子交換柱。儀器測(cè)定系統(tǒng)將預(yù)先編程設(shè)置的由低到高離子濃度的緩沖液注入系統(tǒng)，在這一過(guò)程中，血紅蛋白經(jīng)和分析柱中偶聯(lián)離子結(jié)合的程度大小達(dá)到分離，處理好的樣本自動(dòng)被注入分析通路，分離的血紅蛋白隨后在流經(jīng)光感測(cè)量計(jì)時(shí)，測(cè)量其在415nm的光吸收情況，D-10糖化血紅蛋白測(cè)定系統(tǒng)臨床數(shù)據(jù)處理軟件（CDM）將每次分析過(guò)程中收集到的數(shù)據(jù)還原。此間還要經(jīng)過(guò)兩個(gè)水平的計(jì)算。通過(guò)微積分計(jì)算得出分析結(jié)果和分析圖譜，面積計(jì)算使用了指數(shù)模式的高斯對(duì)數(shù)（EMG），這樣計(jì)算已經(jīng)排除了可變部分的血紅蛋白A1C和氨基甲酰血紅蛋白等干擾成。這些過(guò)程全是儀器自動(dòng)化執(zhí)行，每個(gè)標(biāo)本僅需3min。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1精密度 重復(fù)性評(píng)估是根據(jù)NCCLS推薦的典型方法，批內(nèi)重復(fù)性小于2%，批間精密度小于5%，用于分析的質(zhì)控血清和數(shù)據(jù)處理符合以上NCCLS規(guī)則，見(jiàn)表1。

2.2特殊標(biāo)本干擾

2.2.1 LA1C LA1C≤4%時(shí)，為了確定其干擾程度，選取兩組不同標(biāo)本，一組為正常健康人，一組為糖尿患者，然后樣本中均加入葡萄糖使其濃度調(diào)整到200～700mg/dl。隨后孵育3h以利于生成LA1C后上機(jī)測(cè)定，見(jiàn)下表，高達(dá)4%的LA1C不會(huì)影響HBA1C的測(cè)定。見(jiàn)表2。

2.2.2高血脂樣本 選取兩組不同標(biāo)本，一組為正常健康人，一組為糖尿患者，將標(biāo)本處理使其甘油三酯范圍從100～6000mg/dl，然后配制成如下表的不同濃度，等體積加入不同濃度紅細(xì)胞樣本然后上機(jī)測(cè)定，結(jié)果顯示高達(dá)6000mg/dl的血脂不影響HBA1C的測(cè)定。見(jiàn)表3。

2.2.3黃疸樣本 為了研究黃疸對(duì)此儀器測(cè)定HBA1C的影響，選取兩組不同標(biāo)本，一組為正常健康人，一組為糖尿患者，在樣本中均加入相同濃度的結(jié)合膽紅素然后上機(jī)測(cè)定，結(jié)果表明結(jié)合膽紅素高達(dá)20mg/dl仍不影響該儀器對(duì)HBA1C的測(cè)定。見(jiàn)表4。

2.3參考范圍及線性范圍 BIO-RAD公司D-10糖化血紅蛋白全自動(dòng)分析儀測(cè)定HBA1C的參考范圍為4.1%～6.2%，線性范圍為3.8%～18.5%。

3 討論

3.1糖化血紅蛋白形成取決于血糖濃度及血糖與紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白的接觸時(shí)間，其次生成量與血中葡萄糖嘗試成正比，其糖化反應(yīng)過(guò)程緩慢且相對(duì)不可逆（糖化血紅蛋白一旦形成不再解離）。紅細(xì)胞壽命約為120d，因此糖化血紅蛋白的濃度反映測(cè)定前1～2個(gè)月內(nèi)受試者血糖水平，而與血糖的短期波動(dòng)無(wú)關(guān)，故可作為糖尿病長(zhǎng)期控制的良好標(biāo)準(zhǔn)，也是臨床決定是否需要調(diào)整治療的重要依據(jù)，并作為糖尿病的輔助診斷手段。

3.2影響HBA1C檢測(cè)結(jié)果的因素

3.21藥物 維生素C、E、大劑量的水楊酸、促紅細(xì)胞生成素治療者可使測(cè)定結(jié)果降低。

3.22血紅蛋白的更新異常時(shí)對(duì)HBA1C的影響 任何可以引起紅細(xì)胞平均壽命增加的因素都會(huì)增加HBA1C的濃度且不依賴于血糖的水平，如脾切除后紅細(xì)胞清除率下降。任何可能縮短紅細(xì)胞壽命的因素可能使HBA1C降低，如溶血性貧血，因?yàn)槲闯墒旒t細(xì)胞中的血紅蛋白和周圍葡萄糖結(jié)合少，活動(dòng)性出血會(huì)使網(wǎng)織紅細(xì)胞的生成增加，從而減少紅細(xì)胞的平均壽命。接受透析治療的尿素癥患者紅細(xì)胞壽命縮短。

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