烯效唑時(shí)間分辨免疫分析方法研究

摘要：基于多克隆抗體建立了烯效唑的時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）

關(guān)鍵詞：烯效唑；多克隆抗體；時(shí)間分辨免疫分析

Time-resolved Fluoroimmunoassay for the Detection of the Uniconazole

HONG Xia1，2*，XING Hai-long2，WANG Chenchen2

（1.School of the Environment and Safety Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China；2.Jiangsu wise science and technology development Co.LTD，Zhenjiang 212009，Jiangsu，China）

Abstract：A sensitive time-resolved fluoroimmunoassay（TRFIA）based on polyclonal antibody for detection of uniconazole was developed. A hapten was synthesized and conjugated with ovalbumin（OVA）as the coating antigen. The coating antigen was coated by physical adsorption onto a 96 well microtitre plate，which was then competed with uniconazole in the sample for limited quantity of anti-uniconazole antibody labeled by Eu3 +.Uniconazole in the samples could be determined by direct competition method. At spiked different levels （0.05～0.5 mg/kg in water and soil） recoveries of uniconazole were from 80.4%～116.8%， with CV of 2.6%～8.7%. The TRFIA could be a convenient tool for monitoring uniconazole residues in environment and food samples.

Key words：uniconazole；polyclonal antibody；TRFIA

烯效唑，屬三唑類化合物，是80年代日本住友化學(xué)公司推出的高活性的植物生長(zhǎng)延緩劑和殺菌劑。烯效唑延緩作物生長(zhǎng)的作用機(jī)制在于它能有效的抑制植物體內(nèi)赤霉素（GA）的生物合成，減少體內(nèi)乙烯含量，增加細(xì)胞分裂素（CTK）含量，提高體內(nèi)CTK/IAA的比例，從而使這些內(nèi)源激素調(diào)控的生理效應(yīng)發(fā)生相應(yīng)的變化[1]。烯效唑常用于大田作物、果樹(shù)、蔬菜、煙草、花卉等眾多植物，活性高于多效唑，同時(shí)毒性較低，被廣泛用于農(nóng)業(yè)、園藝植物生產(chǎn)中[2]。

隨著人們對(duì)環(huán)境與食品安全關(guān)注程度逐漸加大，迫切需要建立快速靈敏的檢測(cè)烯效唑殘留的分析方法。烯效唑殘留測(cè)定方法主要是高效液相色譜（HPLC）[3]和氣相色譜（GC）[4]，這些方法前處理比較繁瑣，檢測(cè)結(jié)果受樣品凈化、濃縮等步驟的影響，不適合進(jìn)行批量樣品的快速檢測(cè)，而免疫學(xué)技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越深入，已成為農(nóng)藥殘留分析的重要方法之一。抗烯效唑農(nóng)藥的多克隆抗體的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)（ELISA）也有報(bào)道[5]，但是檢測(cè)靈敏度不高。時(shí)間分辨免疫分析技術(shù)具有高靈敏性、高選擇性、快速等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)普通ELISA免疫分析技術(shù)靈敏度的不足。本研究制備了烯效唑半抗原和多克隆抗體，建立了烯效唑的TRFIA殘留檢測(cè)方法，為環(huán)境與食品中痕量烯效唑殘留高靈敏檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.2包被原的合成

1.3固相包被板的制備

1.5添加樣品的處理 河水經(jīng)過(guò)濾，添加0.05～0.5mg/L的烯效唑標(biāo)樣，用甲醇的PBS稀釋，進(jìn)行測(cè)定。稱取10g土壤，添加0.05～0.5mg/kg的烯效唑標(biāo)樣，混勻，放置過(guò)夜，加入40ml二氯甲烷，超聲10min，4000r/min離心10min，取上清液20ml于圓底燒瓶中減壓濃縮，用含甲醇的PBS定容到10ml。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，各設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，用建立的TRFIA法對(duì)樣品進(jìn)行分析。

1.6測(cè)定

2 結(jié)果與分析

2.1包被原的鑒定 對(duì)半抗原、載體蛋白及偶聯(lián)物進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描見(jiàn)圖1，偶聯(lián)物的紫外吸收光譜發(fā)生了明顯的變化，具有載體蛋白和半抗原的紫外吸收特征。根據(jù)它們?cè)?80nm波長(zhǎng)下的摩爾吸光系數(shù)估算得到包被原的結(jié)合比為7：1。

圖1 半抗原、卵清蛋白及偶聯(lián)物的紫外吸收光譜

圖2 烯效唑TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4抗體的特異性 用TRFIA在相同的條件下測(cè)定與烯效唑結(jié)構(gòu)相似化合物對(duì)抗體的交叉反應(yīng)，計(jì)算各自的抑制中濃度IC50和交叉反應(yīng)率CR（表1），結(jié)果表明得到的抗體對(duì)烯效唑有較好的選擇性，對(duì)大部分三唑類殺菌劑沒(méi)有明顯的交叉反應(yīng)。

2.5回收率測(cè)定 添加不同濃度的的烯效唑標(biāo)樣在河水和土壤中，按照TRFIA進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。在水和土壤中分別添加烯效唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，平均回收率為80.4%～116.8%，變異系數(shù)為2.6%～8.7%，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

3 討論

本文采用TRFIA技術(shù)進(jìn)行烯效唑檢測(cè)。其靈敏度（IC50）較ELISA[5]成倍增加，分析靈敏度可達(dá)到0.2mg/L，靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。可見(jiàn)TRFIA法檢測(cè)烯效唑比ELISA法靈敏度上具有明顯優(yōu)勢(shì)。TRFIA具有獨(dú)特的熒光特性，特異性熒光的衰變時(shí)間極長(zhǎng)，為傳統(tǒng)熒光的103～106倍，激發(fā)光與發(fā)射光之間的Stokes位移可達(dá)290 nm，而普通熒光素的Stokes位移僅為28nm[6-9]，使得試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線飄移小，更提高了試劑的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。本文在研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記抗體和Eu3 +的標(biāo)記量的控制非常重要，它們的量直接影響靈敏度和本底值。研究發(fā)現(xiàn)：低濃度標(biāo)記抗體，標(biāo)記效率高，但本底高；高濃度標(biāo)記抗體，有助于提高靈敏度和降低本底，但其標(biāo)記效率有所下降。

綜上所述，本文建立的烯效唑-TRFIA法，具有靈敏度高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足環(huán)境與食品中痕量烯效唑的檢測(cè)需求，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

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