改性秸稈載體固定化微生物修復石油污染土壤

張秀霞，武海杰，韓雨彤，郭云霞，張守娟

（中國石油大學 環境與安全工程系，山東 青島 266580）

隨著石油開采的加速，石油烴類物質對環境的污染日益嚴重，尤其是“跑冒滴漏”引起的土壤石油污染正威脅著人們的生產、生活。目前，生物法是處理石油污染土壤最經濟有效的方法之一，而固定化微生物技術由于處理效率高、易保持微生物活性等優點而應用廣泛。對于石油污染土壤的處理，固定化微生物技術明顯優于游離微生物修復土壤的效果［1－3］；吸附法制備固定化微生物，因操作簡單、細胞活性損失小而得到了廣泛應用，但存在微生物與載體結合不牢、容易脫落以及易達到吸附飽和的缺陷。載體的比表面積和孔結構等表面物理特性和表面化學特性影響到固定化效率［4］，通過改性可以改變載體表面官能團的種類和數量［5］，從而改變載體的化學吸附［6］、親水性以及疏水性。

目前，國內外學者［7－8］通過改變載體材料的物理化學結構來提高載體材料的吸附性能，提高對廢水中有機物、陰陽離子以及重金屬的去除效率，載體表面的含氧官能團如羥基、羧基和內酯基有利于固定微生物，提高微生物的吸附能力以及結合強度［9－10］。

實驗采用硝酸、硫酸、乙酸和硼酸等對秸稈材料XMG進行改性，以增加XMG表面酸性官能團含量，提高載體對微生物的吸附量，再采用改性XMG吸附法制備固定化微生物，應用于石油污染土壤的修復，考察改性XMG固定化微生物的修復效果，為石油污染土壤的生物修復提供理論指導。

1 實驗方法

1.1 材料

供試土壤采自新疆克拉瑪依油田的風城作業區，pH值范圍7.2～7.4，含水率范圍7%～9%（質量分數），有機質質量分數范圍23.7～35.8g/kg，全氮量范圍14.7～19.8g/kg，有效磷質量分數范圍14.9～19.8g/kg，石油烴質量分數范圍3.4%～4.7%。供試土壤去除植物殘體以及礫石過3mm篩，經自然風干7d后使用。

1.2 富集培養基

牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000mL，pH 值7.0～7.2，121℃滅菌20min。

1.3 實驗方法

1.3.1 XMG的酸性氧化改性

分別用一定濃度硝酸、硫酸、硼酸和乙酸作為改性劑，在一定溫度下改性秸稈XMG一定時間。用蒸餾水將XMG洗至中性，烘干后用于測定XMG表面的酸性官能團、堿性官能團含量，用作載體材料制備固定化微生物。

1.3.2 XMG吸附微生物量的測定

采用光密度OD600間接表示XMG吸附微生物量［11］。向活化12h的50mL菌液中投加40目0.5g的XMG，在30℃、160r/min的搖床中固定微生物。12h后，將錐形瓶取出靜置一段時間倒掉上清液，用生理鹽水將XMG轉移至50mL離心管中（不晃動），1000r/min下離心分離5min。取出后倒掉上層清液，重復3次；加入約10mL生理鹽水于離心管中（劇烈振蕩），1000r/min下離心分離5min，將上層液體過濾至50mL容量瓶，重復3次；用生理鹽水將濾液定容至50mL，搖勻，采用721分光光度計在600nm處測定其OD600值。

1.3.3 XMG表面官能團的測定方法

采用Boehm法［12］測定XMG表面羧基、內酯基、羥基官能團和堿性官能團。

2 結果與討論

2.1 改性條件對改性XMG吸菌性能的影響

2.1.1 改性劑濃度的影響

使用硝酸、硫酸、硼酸和乙酸為不同的改性劑，15℃時，分別在0、1、5、10和15mol/L濃度下，對XMG改性60min，考察改性劑濃度對改性XMG吸菌性能的影響，結果示于圖1。

圖1 改性劑濃度（c（Modifier））對改性XMG吸菌量（OD600）的影響Fig.1 The effect of modifier concentration（c（Modifier））on modified XMG bacteria uptake（OD600）

由圖1可知，隨著酸濃度的增加，改性XMG的吸菌量（即OD600）呈現先增大后減小的趨勢。硝酸、硫酸、乙酸、硼酸摩爾濃度分別為5、5、10和5mol/L時，改性XMG的OD600達到最大值。

酸改性可增加秸稈表面羧基、羥基的含量，同時酸改性秸稈能夠去除秸稈表面的灰質、中和秸稈表面堿性官能團［13］含量，因此在一定濃度范圍內，酸濃度越高，越有利于活性基團的增加；同時，帶有氨基、羧基和羥基等反應性基團的大孔載體在固定化微生物過程中會與微生物發生鍵合，從而提高了固定化微生物的吸附量和穩定性［14］，因此隨著酸濃度的增加，改性XMG的吸菌量呈現增加的趨勢。隨著酸濃度的繼續增加，改性XMG的吸菌量呈現下降的趨勢，這可能是由于高濃度的酸破壞了XMG原有成分，從而不利于吸附微生物［15］。

2.1.2 改性時間的影響

在室溫15℃下，分別采用5mol/L的硝酸、5mol/L的硫酸、10mol/L的乙酸和5mol/L的硼酸對XMG改性，改性時間分別為0、30、60、90、120min，考察改性時間對改性XMG吸菌性能的影響，結果示于圖2。

圖2 改性時間（t（Modification））對改性XMG吸菌量（OD600）的影響Fig.2 The effect of t（Modification）on modified XMG bacteria uptake（OD600）

由圖2可知，對于4種酸改性的XMG，隨著改性時間的延長，其吸菌量呈現先增大后減小的趨勢。5mol/L的硝酸、5mol/L的硫酸、10mol/L的乙酸和5mol/L的硼酸分別在改性時間為60min、60min、30min和30min時，改性XMG的吸菌量達到最大值。

秸稈材料通常具有水溶性差、反應活性不足等缺點，通過適當的改性會破壞原有的有序結構并引進新的功能基團，使其反應活性增強［16］。采用酸改性秸稈材料，秸稈材料表面總堿度隨著改性時間的延長而降低，同時總酸度隨著改性時間的延長而增加，有利于吸附固定化微生物的表面官能團更多地暴露在表面，更容易吸附微生物［13］，因此隨著改性時間的延長，改性XMG吸菌量呈現增加的趨勢；隨著改性時間的繼續延長，改性XMG吸菌量有降低的趨勢，這可能是因為改性時間過長使得XMG的比表面積和孔徑發生了變化，從而不利于吸附微生物。

2.1.3 改性溫度的影響

分別在15、30、50、70和100℃下，采用5mol/L的硝酸改性60min、5mol/L的硫酸改性60min、10mol/L的乙酸改性30min和5mol/L的硼酸改性30min，考察改性溫度對改性XMG吸菌性能的影響，結果示于圖3。

圖3 改性溫度（T）對改性XMG吸菌量（OD600）的影響Fig.3 The effect of modification temperature（T）on modified XMG bacteria uptake（OD600）

由圖3可知，隨著改性溫度的升高，改性XMG吸菌量呈現先增大后減小的趨勢。在70℃下，5mol/L的硝酸改性60min、5mol/L的硫酸改性60min、5mol/L的硼酸改性30min及10mol/L的乙酸在30℃下改性30min時，改性XMG的吸菌量分別達到其最大值；溫度對硝酸改性XMG和硫酸改性XMG的影響不大，故采用硫酸和硝酸改性XMG時可在室溫15℃下進行。酸改性秸稈材料實質上是秸稈材料水解的過程，水解過程有利于引進新的功能基團［17］，故溫度越高，越有利于增加秸稈表面活性基團的數量，與蘭培等［18］關于高溫有利于增加表面酸性官能團的實驗結果一致。隨著溫度的繼續升高，改性XMG吸菌量有下降的趨勢，這是因為XMG中纖維素、半纖維素和木質素的水解溫度不同，若超過纖維素的水解溫度［19］，纖維素發生水解，則會損失吸附菌的活性基團，導致吸菌量的下降。

由上述結果可以得到秸稈XMG的最佳改性條件，分別為5mol/L的硝酸在室溫15℃下改性60min、5mol/L的硫酸在室溫15℃下改性60min、10mol/L的乙酸在70℃下改性30min和5mol/L的硼酸在30℃下改性30min。

2.2 最佳改性條件下改性后XMG的吸菌性能和表面性質

2.2.1 表面化學組成和吸菌性能

最佳改性條件下得到的4種改性XMG的表面官能團含量和吸菌量列于表1。

表1 最佳改性條件下得到的4種改性XMG的表面官能團含量和吸菌量Table 1 The content of surface functional groups and bacteria uptake of modified XMG obtained under optimal modification conditions

由表1可知，在最優改性條件下得到的4種改性XMG的酸性官能團含量整體上高于未改性XMG，堿性官能團含量低于未改性XMG；其中，乙酸改性XMG的酸性官能團含量（如羧基、羥基和內酯基）相對較高、堿性官能團含量相對較少。改性XMG吸菌量整體上高于未改性XMG，且乙酸改性XMG吸菌量明顯高于其他改性方法得到的XMG吸菌量。綜合表面官能團和吸菌量的變化，以10mol/L的乙酸在70℃下改性30min得到的改性XMG為最佳的改性XMG載體。

由表1還可以看出，改性XMG的羧基、羥基和內酯基的含量增多。Yang等［20］的實驗表明，羧基和羥基含量的增加在一定程度上提高了秸稈的極性，從而更有利于微生物的固定化，與周林成等［14］關于微生物固定化的影響因素研究具有一致性。同時，酸改性減少了XMG表面灰分含量、中和了表面部分堿性官能團，且改性時間越長，其表面堿性官能團含量越少，而堿性官能團不利于吸附固定化微生物［10］，因此酸改性可以增強XMG的吸菌性能；乙酸改性XMG吸菌量最大，這與乙酸改性XMG的官能團含量變化具有一致性，是由于XMG在吸附微生物時通過物理吸附極容易達到吸附飽和，而通過酸性官能團固定微生物占主要部分，對吸附微生物起著重要的作用。

2.2.2 表面物理結構

對以10mol/L的乙酸在70℃下改性30min得到的最佳改性XMG進行SEM分析，探究XMG的吸菌性能和其物理結構的關系，并與未改性秸稈XMG對照，結果示于圖4。

圖4 最佳改性XMG樣品和未改性XMG的SEM照片Fig.4 SEM images of XMG and optimal modified XMG sample（a）Modified XMG；（b）XMG

由圖4可知，改性前XMG表面比較規則、平整且致密，改性后XMG的表面粗糙，結構較為疏松，出現了發達的孔隙結構，這樣的結構為微生物的固著提供了有力的條件，同時易于吸附微生物分泌的酶、輔酶或石油烴污染物，從結構上表明改性XMG比未改性XMG能夠吸附更多的微生物，與表1的結果具有一致性。

2.3 改性秸稈XMG固定化微生物修復石油污染土壤

以10mol/L的乙酸在70℃下改性30min得到的改性XMG作為載體材料，采用吸附法制備固定化微生物用于修復石油污染土壤，調整石油污染土壤的C、N、P質量比為100∶10∶1、含水率為20%、翻耕頻率為1次/d，并以未改性XMG固定化微生物、游離微生物和土著微生物修復相同土壤為對照，結果示于圖5。

圖5 采用各種微生物修復石油污染土壤的石油降解率隨時間的變化Fig.5 The oil degradation rate of petroleum contaminated soil by different microbials vs time

由圖5可以看出，石油降解菌的投加明顯提高了石油降解的速率。降解35d，加入高效石油降解菌的土樣，石油降解率從18.2%升至30.3%，固定化微生物的石油降解率比游離微生物的高，達40.6%，改性XMG固定化微生物修復效果稍高于未改性XMG固定化微生物，石油降解率提高到42.9%。改性XMG固定化微生物和未改性XMG固定化微生物其修復效果在修復初始階段效果相差不大，這是因為在初始階段主要進行微生物的增殖，二者在本質上沒有太大的區別，都是多孔的有機載體材料，為微生物提供一個良好的附著體和微環境的緩沖體系［21］。乙酸改性XMG吸菌量比未改性XMG有明顯的增多（見表1），但二者的石油降解率相差不多。這可能是因為，一方面酸的處理增加了XMG表面官能團的數量使其更有利于吸附微生物，但不利于吸附疏水性的石油烴類物質；另一方面酸的處理可能破壞了XMG本身的多孔結構，使得XMG吸附和微生物降解的協同作用［22］出現了阻力，結果使二者的石油降解率相近。

3 結 論

（1）秸稈XMG最佳改性條件為10mol/L的乙酸在70℃下改性30min。在該條件獲得的改性XMG，其酸性官能團中羥基摩爾濃度從改性前的0.08mmol/L增至0.19mmol/L、內酯基摩爾濃度從0.34mmol/L增至1.28mmol/L、羥基摩爾濃度從0.12mmol/L增至1.07mmol/L，吸菌量從0.209增至0.297，表明改性XMG有利于吸附微生物。

（2）對石油污染土壤進行35d修復，固定化微生物的修復效果明顯強于游離微生物和土著微生物，而改性XMG固定化微生物的修復效果比未改性XMG固定化微生物修復效果略有提高，石油降解率從40.6%提高到42.9%。

［1］秦統福，沈本賢，周啟欣，等.包埋法固定UBD菌處理煉油污水工藝研究［J］.石油煉制與化工，2010，41（4）：68-70.（QIN Tongfu，SHEN Benxian，ZHOU Qixin，et al.Study on the biodegradation of refining wastewater by microbial immobilized UBD cells［J］.Petroleum Processing and Petrochemicals，2010，41（4）：68-70.）

［2］山丹，馬放，張思，等.同時培養法與吸附法微生物固定化對比［J］.哈爾濱工業大學學報，2012，44（4）：53-57.（SHAN Dan，MA Fang，ZHANG Si，et al.Comparative study of two immobilization technologysimultaneity culture and adsorption［J］.Journal of Harbin Institute of Technology，2012，44（4）：53-57.）

［3］SHUCHI V，RENU B， VIKAS P. Oily sludge degradation by bacteria from Ankleshwar，India［J］.International Biodeterioration ＆ Biodegradation，2006，57（4）：207-213.

［4］王建龍.生物固定化技術與水污染控制［M］.北京：科學出版社，2001：3-5.

［5］BYUNG J K，SOO J P.Influence of surface treatments on micropore structure and hydrogen adsorption behavior of nanoporous carbons［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2007，311（2）：619-621.

［6］ALBERTO C M，FABIAN S G，AMELIA M A，et al.Activated carbon fibers with a high content of surface functional groups by phosphoric acid activation of PPTA［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2011，361（1）：307-315.

［7］DAE J K，HYUNG I L，JAE E Y，et al.Ordered mesoporous carbons：Implication of surface chemistry，pore structure and adsorption of methyl mercaptan［J］.Carbon，2005，43（9）：1868-1873.

［8］李亞婧，孫曉鋒，王廣征，等.秸稈的改性及吸油能力［J］. 化 工 進 展，2012，31（8）：1847-1851. （LI Yajing，SUN Xiaofeng，WANG Guangzheng，et al.Modification of straw and its oil absorbency［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2012，31（8）：1847-1851.）

［9］RIVERA U J，SANCHEZ P M，GOMEZ S V，et al.Activated carbon modifications to enhance its water treatment applications ［J］.Journal of Hazardous Materials，2011，187（1-3）：1-23.

［10］魏云霞，李斌，李彥峰，等.PVA大孔載體固定化微生物SBBR脫氮［J］.環境科學與技術，2011，34（6）：43-47.（WEI Yunxia，LI Bin，LI Yanfeng，et al.Removing ammonia nitrogen by immobilized microorganism in SBR［J］.Environmental Science ＆Technology，2011，34（6）：43-47.）

［11］武金裝，劉紅玉，曾光明，等.柴油降解菌的篩選及其降解特性研究［J］.農業環境科學學報，2008，27（5）：1742-1746.（WU Jinzhuang，LIU Hongyu，ZENG Guangming，et al.Isolation of oil degradation bacteria and its characteristics in bio-degradation to diesel oil［J］.Journal of Agro-Environment Science，2008，27（5）：1742-1746.）

［12］SOO J P，SUNG Y J.Effect of ozone treatment on ammonia removal of activated carbons［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2005，286（1）：417-419.

［13］汪昆平，徐乾前.幾種不同處理方法對活性炭表面化學性質的影響［J］.環境工程學報，2012，6（2）：373-380.（WANG Kunping，XU Qianqian.Effect of several different treatment methods on surface-chemical properties of actived carbon［J］.Chinese Journal of Environmental Engineering，2012，6（2）：373-380.）

［14］周林成，李彥峰，候英鳳，等.大孔載體固定化微生物處理污水研究［J］.離子交換與吸附，2007，23（6）：531-539. （ZHOU Lincheng， LI Yanfeng， HOU Yingfeng，et al.Study on immobilized microorganism based on macroporous carrier and application for wastewater treatment ［J］.Ion Exchange and Adsorption，2007，23（6）：531-539.）

［15］邵娟，尹華，彭輝，等.秸稈固定化石油降解菌降解原油的初步研究［J］.環境污染與防治，2006，28（8）：565-567.（SHAO Juan，YIN Hua，PENG Hui，et al.Primary study on degradation of crude oil using an oil degrading bacteria immobilized by stalk ［J］.Environmental Pollution ＆ Control，2006，28（8）：565-567.）

［16］李海江，闞曉偉，姜子聞，等.秸稈材料的改性及其在水處理中的應用研究［J］.高分子通報，2011，2：21-28.（LI Haijiang，KAN Xiaowei，JIANG Ziwen，et al.Modified straw materials and their applications in wastewater treatment［J］.Polymer Bulletin，2011，2：21-28.）

［17］SILVERSTEIN RA，CHEN Y，SHARMA S R，et al.A comparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks［J］.Bioresource Technology，2007，98（16）：3000-3011.

［18］蘭培，張淑娟，潘丙才，等.氧化改性對活性炭吸附二苯并噻吩的影響［J］.化工環保，2012，32（5）：471-474.（LAN Pei，ZHANG Shujuan，PAN Bingcai，et al.Effect of oxidation modification on activated carbon adsorption activity to dibenzothiophene ［J］.Environmental Protection of Chemical Industry，2012，32（5）：471-474.）

［19］陳尚钘，勇強，徐勇，等.酸預處理對玉米秸稈纖維組分及結構的影響［J］.中國糧油學報，2011，26（6）：13-19.（CHEN Shangyan，YONG Qiang，XU Yong，et al.Effects of dilute acid pretreatment on fiber components and structure of corn stover［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2011，26（6）：13-19.）

［20］YANG Y X，LU H Y，YING P L，et al.Selective dibenzothiophene adsorption on modified activated carbons［J］.Carbon，2007，45（15）：3042-3044.

［21］席本強.多孔材料的特性分析［J］.科技信息，2007，23：316.（XI Benqiang.Analysis of the feature of porous material ［J］.Science ＆ Technology Information，2007，23：316.）

［22］張秀霞，秦麗姣，黃聰聰，等.微生物固定化載體的選擇及 其性能 ［J］.化 工進展，2010，30（12）：2781-2786. （ZHANG Xiuxia， QIN Lijiao， HUANG Congcong，et al.Study on the selection of immobilized carrier and its performance［J］.Chemical Industry and Engineering Progress，2010，30（12）：2781-2786.）