RGS17 在不同肝癌細胞株及HuH7 裸鼠移植瘤中的表達

曹 靜，王云杰，李俊生（. 臨沂市人民醫院藥學部，山東 臨沂76003；. 臨沂經濟技術開發區人民醫院，山東 臨沂7603）

異源三聚體鳥苷酸調節蛋白（G 蛋白）信號通路在正常肝組織生長和再生中起著重要作用[1]，而在肝癌組織中G 蛋白的表達和功能均失常[2]。鑒于G 蛋白的表達和功能對正常肝細胞及肝癌細胞均有十分重要的作用，作者設想G 蛋白信號轉導調節因子（regulator of G protein signalling，RGS）在調節肝細胞癌形成的過程中可能也起著同樣重要的作用。2013 年1～10 月，作者從體外細胞株和裸鼠體內2 個層面觀察了RGS17 在正常肝細胞和肝癌細胞株的表達，探討其在肝細胞癌發生和發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及動物 肝癌細胞株HepG2、HuH7 及正常肝細胞株THLE-2（上海交通大學上海市腫瘤研究所惠贈）；無特定病原體（SPF）4 周齡雄性裸鼠10 只[購于上海斯萊克動物中心，批號SCXK（滬）2012-0002]。

1.1.2 主要試劑與儀器

1.1.2.1 主要試劑 細胞培養用胎牛血清（美國Gibco 公司原裝進口）和DMEM 培養基（杜氏改良培養基，美國Gibco 公司產品）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time PCR）兩步法試劑盒及逆轉錄酶（日本Takara 公司產品）；Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司產品）；引物（上海生工有限公司合成）；焦磷酸二乙酯（DEPC）水（購自杭州碧云天公司）；氯仿（購自Sigma 公司）；異丙醇（購自德國Merck 公司）；抽提RNA 用無RNA 酶EP 管和real-time-PCR 管（購自美國Axygen 公司）；CCK-8 試劑（日本同仁公司生產，原裝進口）。

1.1.2.2 主要儀器 細胞培養皿和96 孔培養板（美國Corning 公司）；5%CO2細胞培養箱和處理細胞用超凈工作臺（EQR/GL-65，美國Thermo 公司生產）；逆轉錄聚合酶鏈反應儀（美國Bio-Rad 公司生產）；real-time-PCR 儀（美國ABI 公司生產）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 肝癌細胞株HepG2、HuH7 及正常肝細胞株THLE-2 用DMEM 細胞培養液及10%胎牛血清培養，培養液中加入青霉素（100 μg/mL）和鏈霉素（50 μg/mL）以防止細胞污染。細胞在37 ℃、5%CO2無菌細胞培養箱中培養（時間不固定，根據細胞生長情況，至少2 d 以上）。細胞換液、傳代、凍存等操作均在無菌細胞超凈工作臺進行。細胞貼壁生長至80%覆蓋時傳代，先用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，再用2.5%胰酶0.5 mL 消化，鏡下見細胞變圓時棄去胰酶溶液，用含10%胎牛血清培養基吹打，將1 個細胞培養皿的細胞傳入3 個細胞培養皿備用。

1.2.2 細胞增殖活力檢測 將細胞消化計數，鋪入96 孔細胞培養板，每孔約2 000 個細胞。從鋪板第2 天起檢測細胞活性，每天1次。檢測時將孔中培養基吸凈，加入用培養基配成的10%CCK-8檢測試劑，37 ℃放置1.5 h，用酶標儀在450 nm 波長檢測其光密度（OD）值，間接反映細胞活性。

1.2.3 動物皮下移植成瘤模型的建立 取SPF 4 周齡雄性裸鼠10 只，采用自身對照試驗，在裸鼠皮下接種肝癌細胞株HuH7，成瘤后檢測瘤組織（模型組）和肝組織（對照組）中RGS17 mRNA 的表達差異。具體方法如下。

1.2.3.1 模型組 擴增培養HuH7 細胞，從6 cm 培養皿傳入10 cm培養皿，使細胞數達到2×107個；消化細胞，顯微鏡下計數，用不加胎牛血清的DMEM 培養液稀釋細胞至1×104μL-1，置于冰上；用1 mL 注射器將培養的細胞懸液200 μL 皮下注射于裸鼠左側腹股溝處，每3 天觀察成瘤情況；成瘤后28 d 取瘤時，將裸鼠用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，用組織剪剪開裸鼠皮膚，用鑷子及眼科剪協助將腫瘤組織從皮下完整剝離切除，稱質量后放入PBS中等待裂解提取總RNA。

1.2.3.2 對照組 將裸鼠用戊巴比妥鈉麻醉，組織剪小心剪開其皮膚，用鑷子夾起胸骨，剪開腹部肌肉暴露腹腔，將肝臟完全切除，放入PBS 中等待裂解提取RNA。

1.2.4 總RNA 提取及逆轉錄 將1.2.1 中培養的3 種細胞和1.2.3 中移植的瘤塊組織（每塊1 g）用PBS 沖洗，對瘤塊組織和肝組織抽提的RNA，應先用勻漿器勻漿，加入1 mL Trizol 試劑，反復吹打消化后，加入200 μL 氯仿，振蕩混勻15 s，室溫靜置3 min，然后4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。微量移液器吸取上清液放入新的無RNA 酶的1.5 mL EP 管中。每管加500 μL 預先冰上冷凍的異丙醇，-20 ℃沉淀0.5 h，然后4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。離心后可見管底有白色RNA 沉淀，用DEPC 水配制的75%無水乙醇洗一遍后晾干，用50 μL DEPC 水溶解RNA 備用。取1 μL 作為逆轉錄模板，80 ℃5 s、37 ℃15 min 進行逆轉錄。

1.2.5 real-time-PCR 引物序列 將逆轉錄獲得cDNA 稀釋10 倍，取4 μL 為模板配制50 μL 反應液。RGS 上游引物序列：5′-CAGAG GCCCAACAACACCTG-3′；下游引物序列：5′-TGTGGGTCTTCCCGCATTTT-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物序列：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′；下 游 引 物 序 列：5′-ACACCAT GTATTCCGGGTCAAT-3′。反應條件：95 ℃變性30 s、95 ℃退火5 s、60 ℃延伸31 s，40 個循環。擴增產物分別為105、116 bp，得到Ct值后用2-△△Ct方法計算結果。

1.3 統計學處理 應用SSPS11.0 統計軟件進行數據分析，組間比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞活力檢測 細胞培養中，用CCK-8 檢測細胞活力，連續檢測4 d，可見肝癌細胞株HepG2、HuH7 及正常肝細胞株THLE-2的細胞增殖呈穩定上升趨勢（圖1），表明細胞生長狀態良好，可以進行細胞水平mRNA 檢測及裸鼠成瘤實驗。

圖1 肝癌細胞株HepG2、HuH7 及正常肝細胞株THLE-2 增殖曲線

2.2 HepG2、HuH7 及THLE-2 中RGS mRNA 的表達 3 種細胞抽提總RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性見圖2。由圖2 可見，所抽提總RNA 28 s 條帶明亮，提示RNA 完整性好，未見降解，滿足下一步逆轉錄反應及real-time PCR 的需要。real-time PCR結果顯示，設THLE-2 細胞RGS17 mRNA 表達水平為1，HepG2、HuH7 細 胞RGS17 mRNA 表 達 水 平 分 別 為3.20±0.92、11.60±2.53，提示肝癌細胞HepG2、HuH7 表達水平明顯高于正常肝細胞株THLE-2，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖2 3 種細胞抽提RGS17總RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 RGS17 mRNA 在3 種細胞株中的表達

2.3 裸鼠成瘤模型的建立 模型組裸鼠在注射HuH7 細胞后12 d，在裸鼠左側腹股溝處可見皮下瘤塊形成，待其繼續生長14 d后，用游標卡尺檢測腫瘤瘤塊大小，其體積如表1 所示。說明在裸鼠皮下移植肝癌細胞成瘤造模成功。

2.4 裸鼠瘤塊組織及正常肝組織中RGS17 mRNA 的表達 用real-time PCR 方法檢測裸鼠瘤塊組織及肝組織中RGS17 mRNA的表達，發現模型組有8 只裸鼠瘤塊組織中RGS17 mRNA 高表達，2 只裸鼠瘤塊組織中RGS17 mRNA 低表達，見圖4、5。

表1 模型組裸鼠瘤塊生長情況（n=10）

圖4 裸鼠瘤塊組織和肝組織中RGS17 mRNA 的表達

圖5 瘤塊組織和肝組織RGS17 mRNA 表達散點圖

3 討 論

肝癌在所有癌癥中為高發腫瘤，在男性人群中排名第5 位，在女性人群中排名第7 位[3]。世界范圍內每年約有60 萬人死于肝癌，其在發展中國家發病率較高[4]。因此，目前對于肝癌發病機制的研究以及據此制定相應的預防、診斷和治療策略，成為世界范圍內迫切需要研究的重要課題。

G 蛋白位于細胞膜的內表面，是細胞膜表面受體和細胞內效應器的連接橋梁[5]，可調節下游效應器如腺苷酸環化酶信號通路的活性[6]。G 蛋白信號通路在正常肝細胞的生長和再生中起重要作用[7]。在肝細胞癌患者和動物模型中G 蛋白的表達和功能失常。有文獻報道，G 蛋白偶聯受體87（GPR87）可促進肝癌細胞的增殖和遷移[8]；GPR 5 在肝癌細胞表達異常，參與調節肝癌細胞的表型和生存[9]。除上述G 蛋白、GPR 在肝癌的相關研究外，RGS 逐漸被納入人們的研究視線[10]。

RGS 調節G 蛋白信號轉導的頻率和持續時間、細胞內RGS蛋白的分布和活性決定G 蛋白信號轉導的效率以及不同G 蛋白信號轉導通路間的平衡調節[11]。已發表的關于RGS 的研究大多局限在神經系統[12]，而在其他主要器官如肝臟的研究少見。最近有學者研究發現，RGS5 通過促進肝癌細胞從上皮到間質的轉化來促進肝癌的轉移[13]；RGS19 則可以抑制RAS 誘導的腫瘤形成和轉移[14]。

本研究以RGS17 為研究切入點，在體外細胞株和裸鼠動物體內2 個層面發現其在肝癌細胞中表達上調，提示RGS17 可能參與腫瘤的發生和發展，與其他RGS 參與腫瘤的報道互為印證，為肝癌發病機制的研究提供了新的思路，為肝癌的預防和治療提供了新的分子靶點。但有關RGS17 促進肝細胞癌發生發展的具體機制和調節功能尚需進一步研究。

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