人工濕地（SEEP）中重要微生物基因的分布

宋成+安德烈歐格母

摘 要：該論文旨在調查人工濕地SEEP的生態效益和影響。SEEP是與蓄水池相關的雨水生態建設項目的簡稱。該蓄水池具有不可否認的價值，但是卻長期被人們忽視。經過集中調查研究之后，發現這和整個環境具有聯系。例如，（1）產生數噸溫室氣體。（2）處理受污染的水源，例如從水中清除N和P資源。（3）關于碳、氮和硫循環的其他生態有利影響。因此，非常值得探索其功能并建立對濕地功能非常重要的基因分布基準線。該文通過使用DNA提取和PCR技術對SEEP中每個區劃的不同基因種類（例如，dsrB、mcrA、nirK、nirS和amoA基因）進行了研究并將在此進行報告。

關鍵詞：SEEP ?人工濕地 ?dsrB基因 ?mcrA基因 ?nirK ?nirS基因和amoA基因

中圖分類號：X17 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）11（a）-0119-03

濕地是一片無論是永久性還是季節性都充滿水的區域，因此總是呈現出明顯的生態系統特征。濕地與陸地最重要的區別就是濕地有還原性土壤，支持水生植物生長。

由于濕地對動植物和人類有至關重要的好處，成千上萬的生態學家對濕地進行了無數次研究，即使人們過去認為濕地毫無用處，但是現在人們對該系統優勢的認識正處于熱火朝天的趨勢。濕地巨大的、不可或缺的價值包括：

（1）具有商業價值的魚類棲息地。

（2）地下水補給。

（3）休閑機會，例如療養。

（4）美學價值。

（5）改善水質。

（6）厭氧區域的研究價值。

在地球上，有幾種微生物對碳循環、氮循環和硫循環相關的生態系統具有重要的作用。

至于碳循環，濕地可以作為蓄水池儲存非完全氧化碳源或產生甲烷和其他溫室氣體。

硫酸鹽還原菌（SRB）可以對重金屬的直接和間接降解進行調解并有助于有機污染物進行生物降解（3）。因此，使用這些細菌處理徑流水非常有利。SRB還可以將硫酸鹽異化作用和異養碳降解或二氧化碳固定進行結合，碳酸鹽還原會直接影響濕地中的碳循環（17）。對于我的項目來說，我將更加關注相關基因的相對豐度。在這些細菌中所發現的普通基因是dsrB（異化酸性亞硫酸鹽還原酶）基因。我將通過對比這種基因的濃度發現人工濕地的特殊功能。至于其他功能，他們對產甲烷的降解途徑所涉及的含微生物的酶作用物的競爭非常有利（4）。這意味著這些含dsrB基因的細菌也可能參與了產甲烷菌作用。關于濕地甲烷通量的硫酸鹽還原作用在將來有望進一步擴展。

產甲烷菌是地球碳循環過程中的一種必要成分。他們可以在使用氫進行二氧化碳降解或轉移甲基化混合物之前進行厭氧催化產生甲烷。有一種酶能夠刺激受輔酶-M（被稱為甲基輔酶-M還原酶（MCR））束縛的甲基還原。這種酶能夠調節甲烷產生路徑中的目標過程（10）。在特定環境中，例如高pH或高溫環境，人們認為這種受產甲烷菌支配的酶種類繁多。這個因素可能影響濕地SEEP的生態系統（2、10、）。所以，我只選取了mcrA基因作為本項目的目標基因，調查是否任何區劃都能產生與其他循環和生物作用相結合的甲烷。

至于氮循環，由于濕地近似于還原環境，用于處理受污染的城市徑流水，因此我選取了脫氮菌作為研究目標。這指的是水中氮源的降解。現在也有一些詳細說明脫氮作用基因的論文。我選取了nirK和nirS（亞硝酸還原酶）基因進行試驗。脫氮是一種厭氧過程，因為我們需要足夠的水覆蓋土壤。這個過程也結合了其他循環。

最后一種我所感興趣的基因就是amoA（氨單加氧酶）基因。這種基因在濕地中不容易發現，因為含有這種基因的微生物通常生活在含氧環境中。其他科學家已經提純出了一種將單加氧酶特有遺傳密碼編入亞硝酸單胞菌物種中的特殊縮多氨酸，并且我可以從其他論文中獲取這些內容（8）。這些細菌可以調解硝化作用中的一個非常重要的步驟（6）并參與甲烷和一氧化碳循環過程（8、9和10）。除此之外，他們還降解有機物，減少臭味（6）。我們最近發現越來越多的環境科學家在進行厭氧環境中微生物的研究（9）。這也是選擇這種基因的最重要的原因。

1 研究方向

雨水生態建設項目（SEEP）開始于1995年，用于在自然區和教學實驗室（NATL）范圍中其所在地內的研究和教育。從根本上說，這是一個人工濕地，用于處理污染水并在深貯水池中存儲淡水。

雨水徑流指大暴雨時或之后從土地中流走的水。這種徑流會造成大量污染物流入河流、湖泊或土壤下方的地下水中。在暴雨中流走的污染物的類型和來源包括：重金屬、懸浮體、氯化物和其他化學成分，例如碳氫化合物（9）。這些污染物會極大地影響水體的質量和相關生態系統。在城市化地區（例如，大都市），每天都會產生大量廢棄物，如垃圾、油料和重金屬。這些污染物污染了水下的土壤。這些土壤通過生物富集會對人類或其他動物產生不利影響。SEEP能夠收集一些城市地區的暴雨徑流水，緩慢排放，從而減少洪水泛濫的可能性，因此SEEP在處理這個問題方面起到了至關重要的作用。

這也是一個管理計劃，在佛羅里達大學自然區和教學實驗室（NATL）所在地增加一個雨水貯留池進行生物多樣性研究（盡管所列物種相對于自然濕地來說遠遠不夠），同時優化貯水池在研究和教育方面的用途。淡水濕地也在產生優先的溫室氣體甲烷和其他碳化氣水源，但是淡水濕地同時又起到了碳沉積作用（10）。濕地中的水下環境是厭氧的，因此一些濕地促使或幫助厭氧生物存活下來，并通過提供充足的養分使它們發揮作用。這是指產生甲烷和一些發酵產物，例如丙酸鹽、丁酸鹽、醋酸鹽和酵類。

SEEP可分為三個區域：（1）單元I，即前池，其作用是對受污染最嚴重的雨水進行預處理，（2）單元II，其作用是對受污染比較嚴重的雨水渠進行二線處理，（3）單元III，這是深淡水池的所在地。endprint

本研究旨在找到適用于氮循環（對氨單加氧酶進行編碼）、硫循環（硫酸鹽還原）和碳循環（甲烷產生和甲烷氧化）的基因。

根據佛羅里達大學環境保護研究委員會2005-2015年總體綜合規劃，盡管已經證明了SEEP多方面的好處，但是還未充分了解潛在危害徑流的影響，因此需要進一步研究。總而言之，未來研究中充滿挑戰，這也是我選擇將其作為畢業論文題目的原因。我所需要完成的就是提供一個SEEP的輪廓框架，說明某些微生物中基因相對豐度分布。從而使本論文對將來其他進一步的研究起到引導作用。

2 研究目的

該論文的目的是繪制出SEEP在這些方面的整體框架。

2.1 碳循環

SEEP不同區劃中參與碳循環的基因的相對濃度。

2.2 硫循環

SEEP不同區劃中參與硫循環的基因的相對濃度。

2.3 氮循環

SEEP不同區劃中參與氮循環的基因的相對濃度。

3 研究假設

這個區域可能存在各種各樣的氮化物，例如，含有amoA基因的亞硝酸單胞菌只能在含氧環境中生存，我認為amoA基因的濃度應該從T1降低到DM1，或者根本沒有amoA基因。

我應該在所有區域都找到mcrA基因。用于SM1和SM2都屬于厭氧環境，因此在其中應該能找到大量mcrA基因。一些細菌群可以和其他厭氧菌一起生存，是因為他們需要利用厭氧菌，從厭氧菌中獲得發酵產物存活下去。

至于dsrB基因，所有區域應該都含有。

在所有區域（除B1和B2以外）都能找到脫氮原核生物，因為這些種類的細菌需要厭氧環境，例如水下土壤。相關基因有nirK和nirS。

4 材料和方法

4.1 采樣

這次采樣之旅的帶頭人是Clark博士、Alex Rozin、Elise Morison和濕地俱樂部的學生。我們從2013年10月20日開始搜集材料。所需要的工具包括去心器、容器、過濾器、活塞、刀子、袋子、冷干冰、樣品勺、記號筆、數據表、鉛筆、帶夾子的寫字板、地圖、水桶、木槌和手套。我們起初需要將去心器埋入土壤，然后取出來。我們有一個活塞用來將有機質土壤從去心器中擠到一個有刻度的容器中。最終將土壤轉移到塑料袋中，充分混合。之后，再次重復，挖出更深層的土壤。通過土壤顏色就很容易區分礦質土壤和有機土壤。有機土壤的顏色深，但是礦質土壤的顏色十分淺。我們只需要有機土壤。

我們有11個區域。我們從每個區域收集了3份土壤樣品，我們貼上了X-1、X-2和X-3標簽（例如T-1，我們有T1-1、T1-2和T1-3），而DM1，我們只收集了一份樣品。對于深度，每個核心由于其所含的有機物質量不同而有很大的差異，我們從T1-3中收集了2個深度范圍。一個是0～2 cm;另一個是2～16 cm。但是對于T2-3，我們所收集的范圍是0～2 cm和2～7 cm。收集樣品之后，我們將其儲存在了-80℃的冷凍箱中。除非深度在0～2 cm，否則收集不到礦質土壤。（我們有了有機質深度的數據，在0～2 cm深度范圍，這些有機質樣品有一些礦質土壤）

在進行DNA提取之前，第一步是在研缽中將液氮用槌磨碎，磨得越碎越好。然后將土壤樣品變成粉末。

4.2 DNA提取

使用PowerSoil DNA Isolation Kit進行DNA提取。附件A中列出了更加詳細的信息。

下列步驟是通過凝膠電泳檢查結果。對于這個過程，我先制作了一瓶凝膠。凝膠的配方如下：

（1）找到一個合適的瓶子。

（2）稱3g瓊脂糖凝膠。

（3）將所稱的瓊脂糖凝膠添加到瓶子中。

（4）添加200 mL TAE（0.5倍）。

（5）加熱，直到所有固體溶化。

（6）添加2.5 μL/200 mL溴化乙錠。

然后，我需要等凝膠冷卻，準備運行電泳。等到凝膠變得有一點熱的時候，將凝膠倒入容器中并添加0.5倍TAE緩沖。將電泳機器調整到120 V并運行20 min。之后，我將凝膠取出，放到紫外光下進行曝光，然后查看結果。

4.3 聚合酵素鏈鎖反應

聚合酶鏈反應擴大我所需要的基因。附件B中列出了聚合酶鏈反應試驗計劃的詳細內容。為了證實不是由于含有目標DNA的緩沖池或試劑導致擴大，需要一份陰性PCR對照樣品。陰性對照僅包括自分解水、引子和Gotaqs（使用水取代DNA）。

同時，還需要進行陽性對照。以下是進行標準陽性對照的步驟（只選了dsrB基因作為例子）。

（1）從Elise（我們實驗室的一名博士研究生）處獲得LB KAN盤，加熱到37 ℃。

（2）使用活化環從Elise的4盤中記錄dsrB克隆數76。

（3）將克隆品放到LB KAN盤上，并使用曲棍使其散開。（LB KAN是含有抗菌卡那霉素的培養基，將1 mL備用卡那霉素添加到1L熱壓處理過的LB瓊脂中而得到）。

（4）放在37 ℃環境中培養2 d。

（5）取出Elise的LB KAN液體培養基，取出500 μL液體培養基，用移液器吸到盤子上，將生物質擦除，讓他們懸浮在500 μL液體培養基中。使用2轉每分鐘的速度分離10 min。

（6）至于下列步驟，請參見QIAprep Spin Mini Prep Kit（目錄冊# 27104）。

最后一步是為了檢查標準dsrB基因的濃度。城市徑流水從T1流向DM1，從未處理的水變成干凈淡水。T2是另一個處理受污染水的區劃，但是有一個截水溝阻止了水從T2流向DM1。但是，邊緣很少涉及到這個系統。市徑流水從T1流向DM1，從未處理的水變成干凈淡水。T2是另一個處理受污染水的區劃，但是有一個截水溝阻止了水從T2流向DM1。但是，邊緣很少涉及到這個系統。城市徑流水從T1流向DM1，從未處理的水變成干凈淡水。T2是另一個處理受污染水的區劃，但是有一個截水溝阻止了水從T2流向DM1。但是，邊緣很少涉及到這個系統。城市徑流水從T1流向DM1，從未處理的水變成干凈淡水。T2是另一個處理受污染水的區劃，但是有一個截水溝阻止了水從T2流向DM1。但是，邊緣很少涉及到這個系統。城市徑流水從T1流向DM1，從未處理的水變成干凈淡水。T2是另一個處理受污染水的區劃，但是有一個截水溝阻止了水從T2流向DM1。但是，邊緣很少涉及到這個系統。endprint

5 結語

采樣可能存在一些問題。從結果來看，對于每個基因聚合酶鏈反應過程，每個區劃的3個復制品的環境應該幾乎一樣。但很明顯，情況并不是這樣。我從Elise處得知，一些樣品不是從潮濕土壤中獲得的。由于是自然系統，這當然可以理解。在單個位置，不同的采樣位置之間也是各不相同的。這種變量并不意外。因此，我選擇計算平均值，取得更好、更合理的結果。

至于DNA提取產物，我們可以發現，我是從所有區劃中獲得DNA的，因此我可以繼續下列聚合酶鏈反應過程。在他們所包含的有機物中他們的濃度各不相同。我僅對需要進一步試驗的區劃的幾個DNA運行了電泳。DNA的數量能夠反映出有多少有機物。即使對于相同深度，即0～2 cm，我們發現他們的有機物豐度也是不同的。由于有氧環境的消費率比厭氧環境的消費率高，因此厭氧環境DNA平均質量高于有氧環境DNA平均質量。他們可以被完全氧化，但是卻無法積累足夠的有機物。我只在dsrB基因中遇到了一些污染物問題，但是相對于陽性對照和樣品來講，這些污染物微不足道。

dsrB基因的結果是合理的。我們看到T1的dsrB基因豐度最大，緊接著是T2等。這非常適合將城市徑流水沖干凈。含有這種基因的微生物能夠降解受污染水中的硫化源。減少細菌的亞硫酸鹽所需的環境非常復雜。這種環境可能是浸水也可能是水流波動。他們還能和其他細菌（例如，產甲烷菌）互養，這樣產甲烷菌可以利用這些非完全氧化碳源或氫產生甲烷。很明顯，mcrA基因能和dsrB基因結合主要是為了互養。含有mcrA基因的細菌或古生菌需要持續的浸水狀態，這就意味著完全缺氧環境。根據每個區劃的水深，我所獲得的結果是可以理解的。SM1和E2非常接近深水沼澤DM1。因此，他們也需要大量mcrA基因。

NirS和nirK微生物更喜歡波動的浸水環境，例如SM1和SM2。

盡管NirS基因和nirK基因的作用幾乎是一樣的，但是NirS基因的豐度低于nirK基因的豐度。SEEP中種類各異的脫氮物種可以解釋這種情況。一些物種的nirK基因可能比NirS基因多。

amoA基因的結果似乎比較復雜，但是我從另一篇論文中了解到了amoA基因的正確序列和尺寸（10）。由于不同區劃擁有不同類別的化學無機營養氨氧化菌，我因此得出我的結果是有意義的。這也是這些波段的主要原因。非常有趣的是，我們發現即使在深沼澤處也有大量amoA基因。下面就是對此的解釋。在深沼澤處，有一種植物擁有通氣組織。這種植物組織能夠將外部的氧傳送到根部周圍，這樣一些蓄養細菌就可以在這個地方生長。因此，DM1的amoA基因濃度高也就可以理解了。其作用和擁有高濃度的C2相同。

這些基因可以組成一個很長的濕地生物鏈。在深土壤地帶，薄壁組織可以傳送氧，并將氧提供給氨氧化菌。氨氧化菌會將氨鹽基轉化成硝酸鹽并將其釋放到周圍的土壤中。大多數地點都是厭氧的，并遠離植物根部。這些脫氧菌會通過將硝酸鹽轉化成亞硝酸鹽（NO3andNO2）而獲得養分。他們還能和產甲烷菌結合。這些細菌在獲取養分時，他們還能去除水中氮物質。

我的SM1-1土壤樣品仍然沒有獲得基因聚合酶鏈式反應擴增的結果。這也是有可能的，因為該樣品中一些抑制因子組織了聚合酶鏈式反應擴增，例如Taq聚合酶抑制劑。

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