神經電生理記錄的原理與方法

藍永生，蔣艷杰，張殿宇

神經電生理早在兩百年前已被人們所知，但限于記錄手段的制約，其發展較為緩慢。直到20世紀40年代，微電極技術的誕生把人們對神經電的認識帶入了新的時代。在此基礎上，隨著計算機技術及高精密電子設備的研發，人們對神經電生理的研究進入了高速發展時期。如今，神經電生理記錄技術已經成為研究神經功能的重要手段。

1 神經電信號

神經電信號是指在靜息電位基礎上所發生的膜電位變化。靜息電位是指當神經元未受刺激時，細胞膜內外的電位差。靜息電位的變化代表了神經元功能的活動狀態。神經元膜電位變化分為局部電位和動作電位。局部電位包括突觸后電位、感受器電位和效應器電位等，目前在神經電生理領域對突觸后電位的研究較為廣泛。突觸后電位是指化學突觸傳遞在突觸后膜產生的突觸反應，表現為膜電位偏離靜息電位的變化。依據其變化的方向和對突觸后神經元興奮性的影響，可將突觸后電位分為興奮性突觸后電位和抑制性突觸后電位。興奮性突觸后電位是指前膜釋放的興奮性遞質與突觸后膜對應受體結合，使后膜Na+內流速度大于K+外流速度，導致突觸后膜發生局部去極化，而產生興奮性突觸后電位。抑制性突觸后電位是指前膜釋放的抑制性遞質使后膜Cl－大量內流，而產生抑制性突觸后電位。由于突觸后電位屬于局部電位，所以其電位變化會隨著距離的延長迅速衰減，不能進行長距離傳導。但作用于同一神經元的多個突觸后電位可進行整合，若多個未達到閾電位的突觸后電位通過整合達到閾電位水平，便會引發動作電位。

動作電位是指神經元在靜息電位基礎上，受到刺激后膜電位所發生的快速變化過程。動作電位由峰電位和后電位組成，通常意義的動作電位主要指峰電位。峰電位包括從局部電位基礎上迅速去極化的上升支和膜電位迅速復極化形成的下降支。上升支系由刺激引發大量電壓門控Na+通道開放，在電壓差和濃度差的共同驅動下，大量Na+內流產生去極化所致。下降支則是由上升支的去極化導致大量電壓門控K+通道開放，大量K+外流產生復極化所致。動作電位是在局部電位基礎上形成的，大小和形狀固定不變，并且可進行長距離傳播。動作電位是神經元興奮和活動的標志，是神經信息編碼的基本單元［1］。

2 神經電生理記錄

由于神經元的活動主要表現在神經電信號的產生、變化和傳播上，故對神經電記錄和分析是研究神經活動過程的基本手段。目前對神經電信號的記錄方式主要有細胞外記錄、細胞內記錄、膜片鉗和腦電圖技術等。

2.1 細胞內記錄

細胞內記錄的方法是將記錄電極插入神經元胞體內，參考電極通常置于浴液內，記錄神經元膜內的電位變化(圖1)。當神經元接受興奮性神經遞質時，Na+內流使細胞內電壓升高，此時記錄電極處的電壓和參考電極處電壓差發生變化，經放大器放大后便是細胞內記錄的神經元電活動。細胞內記錄的原理是由于細胞膜相對溶液來說具有很大的電阻值，不易在膜兩側產生短路，也不易受到外界干擾，因此細胞內技術記錄到的神經電活動較為真實，所記錄到的信號幅度較大，通常為數毫伏至百余毫伏;記錄到的神經元電活動信息比較全面，因此，細胞內記錄是較為理想的神經電生理記錄技術。

但由于此技術為單細胞記錄，要求將記錄電極插入胞體內，因此對電極的定位和記錄的穩定性要求很高。通常動物的呼吸和心跳等正常生理活動都會對細胞內記錄產生影響，因此在離體記錄中應用比較廣泛，而在清醒動物中成功率較低［2－4］。雖然近年來一些新技術的出現，如頭部錨定技術［5］，使在體細胞內記錄成為可能，但其較低的成功率仍然是阻礙細胞內記錄進一步發展的重要因素。此外由于細胞內記錄使細胞受到物理損傷，導致細胞放電衰減，直至死亡，因此此技術不易進行長時間記錄。

圖1 細胞內記錄

圖2 細胞外記錄

2.2 細胞外記錄

細胞外記錄是把記錄電極插到被測神經元附近(圖2)。而參考電極的位置通常會根據記錄對象而有所不同。如記錄在體腦部神經元，通常會把參考電極固定在顱骨上;而當記錄離體切片時，通常會將記錄電極放置在浴液中。此記錄方法的原理是當記錄電極附近神經元受到刺激時，細胞外液中帶電離子進入細胞內，使細胞膜附近的細胞外液產生電壓變化，并與參考電極處產生電壓差。用這種方法記錄腦部神經元時，可以記錄到突觸后電位和動作電位，但記錄不到靜息電位。而當記錄周圍神經時，只能記錄到動作電位。因為用細胞外技術記錄外周神經的方法通常是將記錄電極和參考電極都放置在神經干上。記錄的原理是根據動作電位具有長距離傳導性。當動作電位依次傳導至兩個電極位置時，導致兩個位置產生電壓差。突觸后電位由于不具備長距離傳輸型，因此不能被記錄。

由于細胞外記錄的電極不需穿過細胞膜，能夠保持細胞功能的完好，因此能夠保持真實的神經元電活動，也能夠進行較長時間記錄。基于此特點，細胞外記錄目前被廣泛應用于檢測清醒動物的神經元電活動。

但由于記錄電極位于各個神經元之間，缺少細胞膜的隔離，因此記錄到的電位比較容易受到外界的干擾，即使電極尖端非?？拷窠浽?，仍然會受到周圍神經元電活動的影響，記錄到的電位實質為多個神經元共同放電的總和，常稱作場電位。另外由于受細胞外液的分流作用，細胞外記錄到場電位幅度非常小，通常為μ級。因此，細胞外記錄不能精確地觀察細胞的正常極化狀態，所獲得的信息較少。

但近年來發展起來的微電極陣列技術，使細胞外技術獲得的信息量越來越多。此技術是在微區域內平均排列多個電極進行多點細胞外記錄。如在直徑約5mm的微區域內排列8×8個直徑小于10um、間距最小30um的電極。運用此技術可在微區域內對神經組織進行較高空間和時間分辨率記錄［1］，以跟蹤分析神經元電信號傳輸和處理過程，并可對學習和記憶過程進行進一步研究［6－10］。微電極陣列技術的出現促進了細胞外記錄的進一步發展，成為神經元網絡研究的重要技術。

2.3 膜片鉗記錄

膜片鉗記錄是對電極尖端吸附的細胞膜片進行膜電流記錄的方法，是在電壓鉗基礎上發展起來的一種新技術，可將細胞膜上一個通道的電位固定在一定水平，觀察流過通道的離子電流。膜片鉗記錄屬于單細胞記錄，因此通常進行離體切片記錄。記錄的方法可分為細胞貼附式、全細胞記錄、內面向外式和外面向外式［1］。

細胞貼附式是膜片鉗技術中其它記錄方法的基礎。記錄的方法是用微電極接觸細胞膜，對微電極施加負壓，使細胞膜吸附在微電極開口處，并形成GΩ以上的抗阻使之封接，在電學上使被封接的細胞膜與周圍組織絕緣，并在此基礎上固定電位，對被封接細胞膜上的離子電流進行記錄(圖3)。這種方式能夠保持細胞的完整性，保證離子的跨膜運動按照正常方式進行。因此若被封接的細胞膜只有單個離子通道，便能夠進行單通道記錄。

圖3 細胞貼附式

圖4 全細胞模式

全細胞模式是在細胞吸附模式上給細胞膜進一步施加負壓，將被封接膜片打穿，記錄膜片以外部位的全細胞膜的離子電流(圖4)。記錄的原理類似于電壓鉗技術，當胞內有離子電流流出時，通過記錄電極向胞內補充反向等量電流，以使膜電位數值保持不變。通過測量經過微電極的電流，間接分析細胞興奮時的離子電流。此外，全細胞模式也可開展電流鉗記錄。電流鉗記錄的原理與細胞內記錄相似，是通過破壞細胞膜，使記錄電極與細胞內液直接接觸，形成低阻抗連接。細胞膜相對細胞內液和細胞外液具有很高的抗阻，所以神經元產生的跨膜離子電流全部通過抗阻較小的穿孔處流入記錄電極，從而記錄到整個神經元的電位活動。因此，全細胞模式既能記錄膜電位和動作電位，也能記錄整個細胞的電流和不同的離子通道電流，此技術在神經生物學的研究中發揮著越來越重要的作用。

內面向外模式在細胞吸附模式基礎上，將形成巨阻抗封接的膜片微電極向上提起，使膜片從細胞體上被切割下來(圖5)。此模式的主要優點是可經浴液介導調控細胞內液的條件。外面向外模式是以全細胞模式為基礎，將膜片微電極向上提起得到切割分離的膜片，膜外面自然封閉而對外(圖6)。這種模式的主要優點是可經浴液介導自由改變細胞外液的條件。

圖5 內面向外模式

圖6 外面向外模式

膜片鉗技術的主要優點在于巨阻封接使露出的電流極少，能夠正確地進行電壓固定。而不足之處在于形成巨阻封接時形成的“Ω”膜片，對細胞造成了不可避免的機械性刺激。但膜片鉗技術的發現對生理科學和神經科學都是一次有重大意義的變革，給生命科學帶來了巨大的前進動力。而此技術的四種記錄方式各有特點，應根據實驗的目的和材料進行選?。?1］。

2.4 腦電圖技術

腦電圖技術是用現代電子放大技術，從放置在頭皮上的電極描記出腦神經細胞的自發生物電活動，通過腦電圖儀加以放大后記錄的腦電波形［12］。在實際應用中，除了可將記錄電極放置于頭皮表面外，還可以放置于皮質表面和皮質內部，參考電極需要放置于沒有電位變化的部位，如耳垂、鼻尖和乳突部等。通常所提及的“腦電”是指頭皮腦電［13］。

腦電圖技術與細胞內記錄、細胞外記錄和膜片鉗記錄相比具有操作方便、記錄過程無損傷等優點，因此被廣泛應用于人類腦功能研究。此技術的記錄原理與細胞外記錄相似，由于神經元群同時發生電位變化，在其周圍產生電場，與參考電極處產生電位差而記錄到電位變化。不同之處在于腦電圖技術的記錄電極與發生電位變化的神經元之間相隔顱骨和頭皮等高阻抗組織，并且距離較遠，因此信號源需產生足夠強的電場才能使帶電離子到達頭皮表面。動作電位由于不具備疊加性，且持續時間較短，致使形成的電場較小而很難被記錄。而突觸后電位由于可發生時空積累，具備形成“強大”電場的條件，因此關于腦電的來源，認同比較多的觀點是來自突觸后電位變化的總和。另外產生突觸后電位的腦部神經元需具有排列緊密且方向一致的特點，這樣有利于產生的電流在空間中的積累，而大腦皮質中錐體細胞恰好符合這一特點。因此通過腦電圖技術記錄到的電位變化實質為錐體細胞產生的突觸后電位變化的總和。另外錐體細胞群接受相似的輸入，并且以方向和時程相似的電位變化對輸入作出響應，有利于產生的電流在同一時間積累。這些特點使錐體細胞群可累積較強的電場，從而穿透顱骨和頭皮等組織而被采集。其它部分的神經元由于排列方向不一致，產生的電場相互抵消，而不能被記錄［15］。目前此技術記錄的自發腦電主要用于腦功能障礙性疾病的輔助診斷。而大腦除自發腦電之外，多數時間是在接受和處理刺激。大腦接收某種刺激后，在腦的特定區域出現的電位反應叫做誘發電位。

誘發電位是在自發腦電基礎上形成的，其幅度較小，被掩蓋在自發腦電中而很難分辨。但因為腦神經元接收特定的刺激后會在固定的時間內出現相同的電位變化，因此誘發電位具有潛伏期恒定和波形恒定兩個特征。通過這一特征，可以通過給受試者重復進行特定刺激，將記錄的數據進行疊加后再平均，就可以將隨機變化的自發腦電抵消而提取到誘發電位。目前誘發電位被廣泛應用于視覺、聽覺和認知等領域研究。

記錄電極和信號源距離較遠，并且相隔顱骨和頭皮等組織，帶電離子到達頭皮的過程中，會被分流到頭皮其它位置，因此腦電圖技術記錄的是大腦中很多信號源產生的電位在記錄點疊加起來的結果，而不能簡單地把頭皮對應的激活位置映射到皮層上去?；诖嗽?，腦電信號源的精確定位一直沒有得到很好的解決。目前解決此問題的方法有間接推算法和直接測量法。簡介推算法主要為腦電溯源分析，此方法是根據頭表測量的電位信號，反演估計腦內神經活動源的位置、方向和強度信息。借助現有的高靈敏度電子設備，此方法可將腦電的時間分辨率精確到毫秒級。但由于腦部解剖結構較復雜，現有的溯源分析算法仍然缺乏準確性。直接測量法通常是將功能性磁共振成像技術與腦電技術結合，此方法可使空間分辨率達到毫米水平，但時間分辨率相對較小，通常以秒為單位，而腦部電活動通常以毫秒為單位，因此功能性磁共振成像技術在時間分辨率上還不能充分滿足研究的需要。

3 展望

神經電生理技術是“窺視”神經活動的窗口，自誕生以來一直受到廣大神經研究者的青睞。近年來其它新技術的不斷涌現，對神經電生理技術的進一步發展起到了很強的促進作用。如無線遙測設備的小型化和輕量化，使人們觀察自然環境中動物的神經電活動成為可能［15－17］;光感調控技術的興起，為人們研究特定神經元功能及神經環路等提供了新的方法［18］。隨著神經電信號收集和處理技術的提高，以及其它輔助技術的發展，神經電生理技術將會在神經科學領域發揮越來越重要的作用。

［1］壽天德.神經生物學［M］.北京:高等教育出版社，2001.

［2］Chorev E，Epsztein J，Houweling AR，Lee AK，Brecht M.Electrophysiological recordings from behaving animals—going beyond spikes［J］.Current opinion in neurobiology，2009(19):513－9.

［3］Lee AK，Epsztein J，Brecht M.Head－anchored whole－cell recordings in freely moving rats［J］.Nature protocols，2009(4):385－92.

［4］Lee AK，Manns ID，Sakmann B，Brecht M.Whole－cell recordings in freely moving rats［J］.Neuron，2006(51):399－407.

［5］Epsztein J，Lee A，Brecht M.Whole－cell recordings of hippocampal CA1 place cell activity in freely moving rats［J］.Soc Neurosci Abstr，2008，690:21－27.

［6］Berdondini L，Van Der Wal P，Guenat O，De Rooij N，Koudelka－Hep M，Seitz P，et al.High－density electrode array for imaging in vitro electrophysiological activity［J］.Biosensors and bioelectronics，2005(21):167－74.

［7］DeMarse TB，Wagenaar DA，Blau AW，Potter SM.The neurally controlled animat:biological brains acting with simulated bodies［J］.Autonomous robots.2001;11:305－10.

［8］Jimbo Y，Tateno T，Robinson H.Simultaneous induction of pathway－specific potentiation and depression in networks of cortical neurons［J］.Biophysical Journal.1999;76:670－8.

［9］Mussa－Ivaldi FA，Miller LE.Brain－machine interfaces:computational demands and clinical needs meet basic neuroscience［J］.TRENDSin Neurosciences.2003;26:329－34.

［10］Shahaf G，Marom S.Learning in networks of cortical neurons［J］.The Journal of Neuroscience.2001;21:8782－8.

［11］陳軍，電生理學.膜片鉗實驗技術［M］:科學出版社;2001.

［12］王維治，羅祖明.神經病學 CM3［M］.北京:人民衛生出版社;2001.

［13］趙曄，王超.腦電圖技術在針灸臨床研究中的應用［J］.Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine.2011;30.

［14］董盟盟，仲軼，徐潔，戴體俊，劉功儉.基于小波分析的腦電信號處理［M］.電子設計工程.2012;20:59－61.

［15］Schregardus DS，Pieneman AW，Ter Maat A，Jansen RF，Brouwer TJ，Gahr ML.A lightweight telemetry system for recording neuronal activity in freely behaving small animals［J］.Journal of neuroscience methods.2006;155:62－71.

［16］Jürgens U，Hage SR.Telemetric recording of neuronal activity［J］.Methods.2006;38:195－201.

［17］Ye X，Wang P，Liu J，Zhang S，Jiang J，Wang Q，et al.A portable telemetry system for brain stimulation and neuronal activity recording in freely behaving small animals［J］.Journal of neuroscience methods.2008;174:186－93.

［18］Berndt A，Yizhar O，Gunaydin LA，Hegemann P，Deisseroth K.Bi－stable neural state switches［J］.Nature neuroscience.2008;12:229－34.