秦巴山區黑木耳主要栽培種內原生質體分離與融合

陳文強 ， 王 進 ， 鄧百萬 ， 彭 浩 ， 解修超 ， 蘭阿峰 ，劉開輝 ， 丁小維 ， 趙娜娜 ， 錢雪婷 ， 蘇晨曦

（1.陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西 漢中723001；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西 漢中723001）

黑木耳（Auricularia auricula）俗稱木耳、細木耳、光木耳、云耳，分類上屬層菌綱，木耳目，木耳科，木耳屬（Auricularia）。木耳屬食用菌不僅含有極高的營養價值和藥用價值，同時熱量很低，是一種健康美味食藥用菌[1]。

原生質體及其融合技術是近年來迅速發展的生物工程育種新技術，空間細胞融合技術、非對稱細胞融合技術、離子束細胞融合技術等新進展已應用于原生質體育種，在食用菌遺傳育種上已取得了可喜的成績[2-3]。迄今，國內外學者已從杏鮑菇、白靈菇、平菇、雙胞蘑菇、美味牛肝菌、冬蟲夏草等50多種食用菌中成功制備原生質體，并結合分子生物學技術就食用菌育種進行了大量的研究，取得了令人矚目的進展[4-12]。近年來，食用菌原生質體融合技術迅速發展，關于種內、種間及屬間原生質體融合都不斷有新的進展。2010年，郭成金等[13]采用雙親滅活標記法對冬蟲夏草和蛹蟲草進行原生質體融合的研究，并利用形態學、頡頏實驗及分子手段方法對融合子進行鑒定；2011年，江力等[14]采用原生質體融合及再生對茶樹菇和雞腿菇進行融合，并通過菌落表型的比較和頡頏反應驗證再生出的為融合子；2012年，全衛豐等[15]采用化學融合方法對兩株不同性狀的靈芝菌株進行原生質體融合選育，通過酯酶同工酶篩選富硒高產靈芝；2013年，陳建中等[16]采用雙親滅活原生質體融合技術選育耐低溫草菇菌株。

目前，木耳屬原生質體方面的研究多數還集中在以黑木耳為材料的原生質體制備及再生條件的探究，采用原生質體化學融合技術對木耳屬不同的菌種進行融合的實驗尚未成功?；趯η匕蜕絽^黑木耳新科、耳 268、秦單 4#、耳 2、耳 913、神農 A8、耳97-2等7個主要栽培菌株形態特征和核糖體轉錄間隔區（ITS）的序列分析，確定了各菌株之間的親緣關系[17]，在此基礎上，作者對秦巴山區黑木耳主要栽培種神農A8與秦單4#的原生質體進行分離與融合。同時，優化黑木耳菌株原生質體制備、再生及融合的條件，為秦巴山區黑木耳優良菌種的選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 神農A8與秦單4#黑木耳栽培菌株：由陜西省資源生物重點實驗室食藥用菌菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養基

CPDA綜合培養基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g， 蛋白胨 3.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，VB10.01 g，瓊脂 20.0 g，加水至 1 000 mL。

液體培養基：CPDA綜合培養基（無瓊脂）。

液體再生培養基：液體培養基+109.3 g甘露醇。

原生質體再生培養基 （Regeneration Medium，RM）：RM1：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，加水至 1 000.0 mL；RM2：馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨3.0 g，瓊脂20.0 g，加水至1 000.0 mL；RM3：馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖 20.0 g，蛋白胨 3.0 g，KH2PO45.0 g， 瓊脂 20.0 g， 加水至 1 000.0 mL；RM4：馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖 20.0 g，蛋白胨 3.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，VB1 0.01 g， 瓊脂20.0 g，加水至 1 000.0 mL；RM5：CPDA 綜合培養基+109.3 g甘露醇。

1.1.3 主要試劑 穩滲劑：KCl、MgSO4、蔗糖和甘露醇 （濃度為 0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L）， 磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 5.8）；酶液：先用 0.05 mol/L pH 5.8的磷酸鹽緩沖液配置滲透壓穩定劑，再用該穩滲劑配置濃度為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的酶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用；融合劑：用滲透壓穩定劑（0.5 mol/L甘露醇）將PEG聚乙二醇配置成質量濃度為 30、35、40、45、50、55、60 g/dL 的融合劑，且內含0.05 mol/L CaCl2。

1.1.4 主要儀器與設備 恒溫振蕩器：ZHWY-210 2C，上海智誠分析儀器制造有限公司；超凈工作臺：SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術有限公司；電子天平：BJ100M，上海精科天美科學儀器有限公司；立式圓形壓力蒸氣滅菌器：LS-B50L，上海醫用核子儀器廠；人工氣候箱：LRH-800-GS，韶關市明天環保儀器有限公司；恒溫水浴鍋：DZKW-S-4，惠州市新旭實業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌絲培養 向長滿黑木耳菌絲的試管菌種中加入5.0 mL液體培養基，用接種針刮去菌種表面全部菌絲，將此帶有菌絲的培養液倒入裝有40.0 mL液體培養基的三角瓶中，28℃靜置培養5～9 d，每天輕搖幾次。

1.2.2 菌絲收集 無菌條件下用尼龍網布過濾收集菌絲體，無菌水沖洗一次，無菌濾紙吸干水分，再用穩滲劑沖洗，4℃下5 000 r/min離心10 min，去掉上清液，重復一次。

1.2.3 原生質體的制備 向裝有菌絲的離心管中分別添加1.5 mL蝸牛酶液、溶壁酶液及果膠酶液，振蕩2 min混勻，在20～40℃水浴中酶解2～4.5 h，每隔一段時間振蕩混勻一次。吸取少量酶液，40倍光學顯微鏡下用血球計數板計數。

1.2.4 原生質體的再生 酶解結束后過濾掉菌絲，無菌管收集濾液，用穩滲劑洗滌離心兩次，3 000 r/min離心10 min。向濾液中加入等體積的穩滲劑搖勻，吸取0.1 mL原生質體懸液涂布于再生培養基上。25℃下靜置培養10～15 d，觀察平皿中的再生菌落數，挑取再生菌株備用。

1.2.5 單核原生質體再生菌株的篩選 光學鏡檢：配置10%的KOH和3%的剛果紅，各滴一滴在載玻片上，加18 mm×18 mm的長有黑木耳菌絲的蓋玻片。光學顯微鏡下觀察再生菌株的菌絲，鑒定鎖狀聯合的有無，篩選出沒有鎖狀聯合的單核再生菌株。熒光鏡檢：在長滿黑木耳菌絲的蓋玻片上加入DAPI進行染色，染色時間為40 min，用蒸餾水沖洗，然后加入熒光增白劑染色4～5 min，再次用蒸餾水沖洗。置于熒光顯微鏡下，觀察染色情況，對樣品進行快速照相備用。此方法再次確定再生菌株鎖狀聯合的有無，篩選出沒有鎖狀聯合的單核再生菌株。

1.2.6 親本原生質體的滅活 熱滅活標記親本神農A8：將篩選出來的單核再生菌株神農A8制成的原生質體懸液分別置于40～50℃水浴保溫10～30 min，結束后涂布于再生培養基上，25℃避光靜置培養10～15 d，記錄再生菌落數。每個處理3次重復，設置一組未做熱處理的原生質體作對照，確定原生質體熱滅活致死臨界點；紫外滅活標記秦單4#：將篩選出來的單核再生菌株秦單4#制成的原生質體懸液200 uL涂布于再生培養基上，15 W紫外燈下30 cm處開蓋，分別照射1～5 min，照射結束后立即蓋緊，黑紙包裹好，25℃避光靜置培養10～15 d，記錄再生菌落數。每個處理3次重復，設置一組未做紫外滅活處理的原生質體作對照，確定原生質體紫外滅活致死臨界點。

1.2.7 原生質體的融合 將兩個用不同方式滅活標記的親本原生質體懸液各1.0 mL混勻離心，棄上清液，加入1.5 mL質量濃度為30～55 g/dL內含0.05 mol/L CaCl2，融合溫度為25～40℃，融合時間10～40 min。融合結束立即用穩滲劑洗滌離心兩次，稀釋后涂布于再生培養基上，記錄再生菌落數。

融合率=融合子再生菌落數/原生質體總數。

1.2.8 融合子的鑒定 根據擷抗反應對融合子進行篩選，通過觀察菌落表型進行初步鑒定。

2 結果與分析

2.1 原生質體的制備

試驗在溶壁酶作用下原生質體的釋放量效果最好，釋放量神農A8為0.94×107個/mL，秦單4#為1.44×107個/mL，其次為蝸牛酶、果膠酶。因此，選用溶壁酶進行試驗。

2.1.1 溶壁酶濃度 選擇溶壁酶濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L 進行試驗。結果見圖 1。 2.0 mol/L時原生質體釋放量達最大，黑木耳秦單4#和神農A8原生質體釋放量分別為1.44×107、0.94×107個/mL。在一定范圍內，原生質體釋放量隨溶壁酶的濃度增加而升高，當溶壁酶濃度為2.0 mol/L時，原生質體釋放量最高，隨后隨著溶壁酶濃度的增加而降低。因此，黑木耳原生質體制備的最佳溶壁酶濃度為2.0 mol/L。

圖1 溶壁酶濃度對原生質體釋放量的影響Fig.1 Effect of lywallzyme’s concentration on protoplast yield

2.1.2 酶解時間 選擇酶解時間分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h 進行試驗，結果見圖 2。 酶解時間為3.5 h時原生質體釋放量達最大，黑木耳秦單4#和神農A8原生質體釋放量分別為1.38×107、0.88×107個/mL。一定時間范圍內，原生質體釋放量隨酶解時間的延長而增加，酶解時間達到3.5 h后反而會導致原生質體釋放量下降。因此，黑木耳原生質體制備的最佳酶解時間為3.5 h。

圖2 酶解時間對原生質體釋放量的影響Fig.2 Effect of digesting time on protoplast yield

2.1.3 酶解溫度 選擇酶解溫度分別為20、25、30、35、40℃進行試驗，結果見圖3。酶解溫度為30℃時原生質體釋放量達最大，黑木耳秦單4#和神農A8原生質體釋放量分別為 1.38×107、0.88×107個/mL。對于大多數食藥用菌，最佳酶解溫度范圍是28～34℃。在一定溫度范圍內，原生質體的釋放量呈先上升后下降之趨勢，在30℃時達到最大值。低于或高于此溫度，酶活力均受影響，從而原生質體的釋放量也受影響。 因此，黑木耳原生質體制備的最佳酶解溫度為30℃。

圖3 酶解溫度對原生質體釋放量的影響Fig.3 Effect of digesting temperature on protoplast yield

2.1.4 出發菌齡 選擇出發菌齡分別為5、6、7、8、9 d進行試驗，結果見圖4。香菇菌株菌齡為7 d時原生質體釋放量達最大，黑木耳秦單4#和神農A8原生質體釋放量分別達 1.44×107、0.94×107個/mL。 在一定范圍內，隨著菌齡的延長，原生質體釋放量先增加后下降，在第7天原生質體釋放量達最高值。培養時間過長，原生質體釋放量隨之下降，這與菌體細胞老化以及細胞壁上不易被酶解的物質的沉積及發酵后其細胞活力下降，產生很大比例的非活性個體有關[18]。因此，黑木耳原生質體制備的最佳出發菌齡為7 d。

圖4 出發菌齡對原生質體釋放量的影響Fig.4 Effect of mycelial age on protoplast yield

2.1.5 滲透壓穩定劑種類及濃度 選擇滲透壓穩定劑分別為KCl、MgSO4、蔗糖和甘露醇，再將最佳的滲透壓穩定劑配制成 0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L進行試驗，結果見圖5。利用不同滲透壓穩定劑制得的原生質體釋放量由多到少的順序依次為：甘露醇＞MgSO4＞蔗糖＞KCl。圖6所示，以甘露醇作為滲透壓穩定劑，在0.5 mol/L原生質體釋放量達最大。在一定范圍內，原生質體釋放量隨濃度的增加而升高，再隨著濃度的增加原生質體釋放量反而減少。因此，黑木耳原生質體制備的最佳滲透壓穩定劑種類及濃度分別為甘露醇和0.5 mol/L。

圖5 滲透壓穩定劑對原生質體釋放量的影響Fig.5 Effect of osmotic pressure stabilizer on protoplast yield

圖6 滲透壓穩定劑濃度對原生質體釋放量的影響Fig.6 Effect of osmotic pressure stabilizer’concentration on protoplast yield

2.2 原生質體的再生

選擇原生質體再生培養基分別為RM1、RM2、RM3、RM4、RM5進行試驗。表1表明，在最佳條件下得到的原生質體分別在供試的5種培養基中均能再生，在RM5培養基上生長的神農A8和秦單4#菌落數分別為9和11，再生率分別為1.91%和1.53%；在RM1培養基上生長的神農A8和秦單4#菌落數分別為1和2，再生率分別為0.21%和0.28%。因此，黑木耳原生質體再生的最佳培養基為RM5。

表1 再生培養基對原生質體再生的影響Table 1 Effect of different regeneration medium on the regeneration rate of protoplast

2.3 原生質體單核化

2.3.1 光學鏡檢 取黑木耳原生質體再生菌株在光學顯微鏡（40×）下觀察菌絲鎖狀聯合的有無，結果見圖7。黑木耳菌株秦單4#和神農A8菌絲均無鎖狀聯合。

圖7 單核菌絲顯微鏡檢Fig.7 Monocyte hyphae by microscope

2.3.2 熒光鏡檢 由于木耳菌絲極細，普通光鏡下很難確定判斷鎖狀聯合。通過熒光染色方法對單核再生菌株進行確定，結果見圖8。進一步確定黑木耳菌株秦單4#和神農A8菌絲均無鎖狀聯合。

圖8 單核菌絲熒光鏡檢Fig.8 Monocyte hyphae by fluoroscope

2.4 原生質體滅活標記

目前，滅活標記法被認為是最有適用的通用標記方法。熱滅活使核糖體16S亞基受損，細胞內功能蛋白、酶蛋白的結構變形或合成受到影響，從而使原生質體失去再生能力，產生致死作用；紫外滅活破壞細胞核，造成DNA分子結構扭曲，使細胞核變形失活，同時保留其細胞質、蛋白質、氨基酸等活性物質。在原生質體融合時，損傷部位不同的雙親原生質體通過遺傳互補相結合，從而達到育種選育之目的[13]。

2.4.1 熱滅活標記 取神農A8單核再生菌株原生質體進行熱滅活試驗，滅活溫度分別選擇40、45、50℃，滅活時間分別為 10、20、30 min，觀察不同熱滅活溫度、不同滅活時間的原生質體的再生。表2結果表明，當溫度達到50℃、時間超過20 min時，沒有再生菌落萌發，原生質體可達100%致死效果。因此，神農A8單核再生菌株原生質體熱滅活致死臨界溫度和時間分別為50℃、20 min。

表2 熱滅活標記原生質體再生菌落數Table 2 Heat inactivated marker of protoplast regeneration strains

2.4.2 紫外滅活標記 取秦單4#單核再生菌株原生質體進行紫外滅活試驗，將原生質體懸液暴露于15 W 紫外燈下分別照射 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 min，結果見圖9。當紫外滅活時間超過3.5 min時，原生質體即可全部致死。因此，秦單4#單核再生菌株原生質體紫外滅活致死臨界時間為3.5 min。

圖9 紫外滅活致死率Fig.9 Death rate of ultraviolet inactivation

2.5 原生質體融合

2.5.1 PEG質量濃度 選擇PEG質量濃度分別為30、35、40、45、50、55 g/dL 內 含 0.05 mol/L CaCl2PEG進行試驗，研究其對黑木耳神農A8和秦單4#原生質體融合的影響，結果見表3。

表3 PEG質量濃度對原生質體融合的影響Table 3 Effect of PEG concentration on protoplast fusion

表3結果表明，PEG質量濃度為30 g/dL時原生質體融合成功率較高，融合子再生菌落數為78個。PEG質量濃度在30～60 g/dL間，較適合真菌原生質體的融合。在一定范圍內，PEG質量濃度過高時，雖然原生質體的融合機會大增，但質量濃度的增加也使得更多的融合子受到毒害，質量濃度過高會導致原生質體皺縮甚至中毒，融合子存活率降低。因此，原生質體融合的最佳PEG質量濃度為30 g/dL。

2.5.2 融合時間 選擇融合時間分別為10、20、30、40 min進行試驗，結果見表4。

表4 融合時間對原生質體融合的影響Table 4 Effect of fusion time on protoplast fusion

表4表明，PEG融合30 min時，融合子再生菌落數為65個。PEG融合時間是融合的最關鍵因素之一，尤其是PEG結合高Ca2+、高pH溶液處理時，時間長短非常重要。PEG溶液加入后，原生質體間即強烈地發生黏著，融合能長時間有效進行。由于PEG有一定的毒性，處理時間過長，會導致原生質體失活；時間過短原生質體融合不穩定。因此，在原生質體充分融合后，必須用穩滲劑及時對其進行離心洗滌。因此，原生質體融合的最佳時間為30 min。

2.5.3 融合溫度 選擇融合溫度分別為25、30、35、40℃進行試驗，結果見表5。

表5 融合溫度對原生質體融合的影響Table 5 Effect of fusion temperature on protoplast fusion

表5表明，35℃時融合子再生菌落數為72個。在一定范圍內，細胞膜在較高溫度下流動性增加，PEG黏度下降，有利于原生質體融合；溫度超過35℃反而會影響原生質體融合[14]。因此，原生質體融合的最佳溫度為35℃。

2.6 融合子的鑒定

2.6.1 融合子與親本的擷抗反應 黑木耳兩親本菌株和融合子于CPDA培養基中，28℃培養，10～15 d后觀察菌絲的擷抗反應，結果見圖10。

圖10 融合子與親本的擷抗反應Fig.10 Antagonism of fusant and parents

由圖10融合子與親本的擷抗反應可知，融合子與親本之間產生了明顯的擷抗現象，可以確定融合子在原生質體滅活和融合過程中發生了核遺傳要素的變異。

2.6.2 融合子再生菌落的表型觀察 黑木耳兩親本菌株和融合子于CPDA培養基中，28℃培養，觀察菌絲的生長速度、色澤及菌絲密度并記錄，結果見表6和圖11。

表6 黑木耳菌株菌絲的形態觀察Table 6 Mycelia morphology investigation in different Auricularia auricular strains

圖11 融合子及兩親本的菌落表型Fig.11 Colonial phynotype observations of the fusant and its parents

表6和圖11結果表明，神農A8的菌落邊緣較整齊，菌絲較粗，生長速度5.2 mm/d；秦單4#的菌落邊緣不規整，菌絲較細，生長速度6.2 mm/d；融合子生長速度6.0 mm/d，介于兩者之間。

3 結語

影響原生質體數量的因素很多，包括出發菌齡、溶壁酶濃度、酶解溫度及時間、滲透壓穩定劑種類及濃度等。研究表明，培養了7 d的黑木耳菌絲體用0.5 mol/L甘露醇做穩滲劑，2.0 mol/L的溶壁酶酶解，30℃下水浴3.5 h所產生的原生質體釋放量達最大，神農 A8和秦單 4#分別 0.94×107、1.44×107個/mL。

原生質體的再生受很多因素影響，其中再生培養基組分對其影響最大。研究表明，當再生培養選擇RM5時，原生質體再生率達最高。其培養基組分為：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，VB10.01 g， 瓊脂20.0 g，109.3 g甘露醇加水至1 000 mL。

采用雙滅活手段對親本進行遺傳標記的關鍵在于方便挑選融合子和篩選損傷程度最小的臨界致死劑量。研究表明，黑木耳原生質體熱滅活致死臨界溫度為50℃，時間為20 min，原生質體紫外滅活致死臨界時間為3.5 min。孫露[19]的研究表明，木耳原生質體熱滅活致死臨界溫度為50℃，時間為10 min，原生質體紫外滅活致死臨界時間為3 min；賀建超[20]的研究表明，木耳原生質體熱滅活致死臨界溫度為65℃，時間為30 min，原生質體紫外滅活致死臨界時間為3 min。這可能是由于黑木耳不同品種的遺傳差異所致，所以在應用雙親滅活法進行原生質體融合前要篩選出最適的雙親滅活臨界點。

影響原生質體融合的主要因素包括融合劑PEG質量濃度、融合時間及融合溫度等。研究表明，使用30%聚乙二醇（PEG4000）和 0.05 mol/L CaCl2溶液 （pH 10）為助融劑，35℃融合30 min效果最好。楊國良采用的電融合法得到毛木耳與黑木耳的融合率為1.7×10-4，是PEG法的50倍左右。但是，電融合法的成本極高，而且操作技術要求比較高，而二者融合的效果基本一致。

根據菌落表現及擷抗反應分析，可得出融合子確系經熱滅活標記和紫外滅活標記的黑木耳原生質體融合產物說明，以單核再生菌株原生質體作為親本，分別采用熱滅活和紫外滅活時雙親原生質體進行遺傳標記，利用PEG在適宜條件下進行原生質體融合，可得到與雙親遺傳性狀不同的融合子。作者對秦巴山區黑木耳主要栽培種神農A8和秦單4#進行了原生質體的分離和融合，得到的融合子是否適宜于秦巴山區栽培并表現出優質高產性狀有待進一步研究。

[1]陳麗華，章克昌.8味中藥對黑木耳發酵的影響[J].食品與生物技術學報，2007，26（5）：104-108.CHEN Lihua，ZHANG Kechang.Effects of eight kinds of Chinese traditional medicines on submerged fermentation of Auricularia auricular[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2007，26（5）：104-105.（in Chinese）

[2]Muralidhar R V，Panda T.Fungal protoplast fusion[J].Bioprocess Engineering，2002，22：429-431.

[3]李守勉，李明，邢蕾，等.食用菌原生質體技術應用的研究[J].安徽農業科學，2007，35（25）：7770-7771.LI Shoumian，LI Ming，XING Lei，et al.Application of protoplast technology of edible mushroom [J].Journal of Anhui Agricultural Sciences，2007，35（25）：7770-7771.（in Chinese）

[4]劉敏，李娟，周波，等.杏鮑菇原生質體制備與再生條件初探[J].生物技術，2005，15（1）：54-55.LIU Min，LI Juan，ZHOU Bo，et al.Separation and regeneration of Pleurotus erygll proto plast[J].Biotechnology，2005，15（1）：54-55.（in Chinese）

[5]鄧百萬，陳文強.美味牛肝菌胞外多糖高產菌株的誘變選育[J].食品與生物技術學報，2006，25（6）：49-53.DENG Baiwan，CHEN Wenqiang.Screening of high exopolysaccharide yield strain of Boletus edulis by UV ray[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2006，25（6）：49-53.（in Chinese）

[6]Yoo Y B，Peerdy，You C H.Studies on protoplast isolation from edible fungi[J].Korean Journal of Mycology，1985，13（1）：1-10.

[7]孫溪，郭成金.雙孢蘑菇原生質體制備條件的優化[J].天津師范大學學報：自然科學版，2006，26（4）：32-35.SUN Xi，GUO Jincheng.Optimizing conditions of preparing Agaricuz bisporus protoplast[J].Tianjin Normal University：College of Chemistry and Life Science，2006，26（4）：32-35.（in Chinese）

[8]劉文芳，郭成金.白靈菇原生質體制備與再生研究[J].天津師范大學學報：自然科學版，2012，32（1）：88-91.LIU Wenfang，GUO Chengjin.Study on protoplast preparation and regeneration of Pleurtus nebrodensis Lnzenga[J].Tianjin Normal University：College of Chemistry and Life Science，2012，32（1）：88-91.（in Chinese）

[9]潘丹丹，肖巖巖，陳超，等.冬蟲夏草無性型菌絲體的原生質體制備條件研究[J].安徽農業大學學報，2012，39（5）：793-797.PAN Dandan，XIAO Yanyan，CHEN Chao，et al.Conditions for protoplast preparation of Ophiocordyceps sinensis[J].Journal of Anhui Agricultural University，2012，39（5）：793-797.（in Chinese）

[10]李省印，李孟樓，胡彩霞，等.平菇種內原生質體分離與融合雜交育種技術及應用[J].西北農業學報，2004，13（14）：146-151.LI Shengyin，LI Menglou，HU Caixia，et al.The techniques and application of intraspecific protoplast isolation and fusion crossbreeding in Pleurotus ostreatus[J].Agriculturae Borealioccidentalis Sinica，2004，13（14）：146-151.（in Chinese）

[11]范雷法，潘慧娟.食用菌屬間原生質體融合研究初報[J].中國食用菌，2005，24（5）：21-27.FAN Leifa，PAN Huijuan.Studies on the intergeneric fusion of protoplasts from edible mushrooms[J].Edible Fungi of China，2005，24（5）：21-27.（in Chinese）

[12]許美燕，唐傳紅，張勁松，等.利用SRAP和ISSR建立快速鑒定靈芝屬菌株的 SCAR標記[J].菌物學報，2008，27（5）：707-717.XU Meiyan，TANG Chuanhong，ZHANG Jinsong，et al.Development of SOAR markers based on SRAP and ISSR for rapid identification of Ganoderma strains[J].Mycosystema，2008，27（5）：707-717.

[13]郭成金，趙潤，朱文碧.冬蟲夏草和蛹蟲草原生質體融合初探[J].食品科學，2010，31（1）：165-171.GUO Chengjin，ZHAO Rui，ZHU Wenbi.Protoplast Fusion between Cordyceps sinensis and Cordyceps militaris[J].Food Science，2010，31（1）：165-171.（in Chinese）

[14]江力，黃健威，慈凌坤，等.茶樹菇與雞腿菇原生質體融合及再生[J].食品科學，2011，32（1）：141-144.JIANG Li，HUANG Jianwei，CI Linkun，et al.Protoplast fusion and regeneration of Agrocybe aegerita and Copyinds comatus[J].Food Science，2011，32（1）：141-144.（in Chinese）

[15]全衛豐，何靜霞，汪潔，等.原生質體融合選育富硒高產靈芝的研究[J].食用菌，2012（3）：19-21.JIN Weifeng，HE Jingxia，WANG Jie，et al.Studies on the Ganoderma lucidum rich in selenium by protoplast fusion[J].Edible Fungi，2012（3）：19-21.（in Chinese）

[16]陳建中，祝子坪，吳瀟，等.雙親滅活原生質體融合技術在草菇耐低溫菌株選育上的應用[J].中國農業科技導報，2013，15（5）：166-172.CHEN Jianzhong，ZHU Ziping，WU Xiao，et al.Application of inactivated parental strain protoplasts fusion technology in selection of Volvariella volvacea with higher antifreeze capacity[J].Journal of Agricultural Science and Technology，2013，15（5）：166-172.（in Chinese）

[17]王進，陳文強，鄧百萬，等.基于形態特征和ITS序列分析秦巴山區黑木耳主要栽培種的親緣關系[J].食品與生物技術學報，2014，33（5）：535-541.WANG Jin，CHEN Wenqiang，DENG Baiwan，et al.Analysis of the genetic relationships of main Auricularia auricular cultispecies in qinba mountainous area based on ITS sequence[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（5）：535-541.（in Chinese）

[18]李楠，許修宏.黑木耳原生質體制備及再生的研究[J].東北農業大學學報，2009，40（7）：34-37.LI Nan，XU Xiuhong.Protoplast preparation and regeneration of Auricularia auricula[J].Journal of Northeast Agricultural University，2009，40（7）：34-37.（in Chinese）

[19]孫露.木耳屬遺傳多樣性及原生質體育種的研究[D].長春：吉林農業大學，2012.

[20]賀建超，賀榆霞.木耳滅活原生質體融合育種研究[J].中國食用菌，2003，22（5）：16-18.HE Jianchao，HE Yuxia.Study on the breeding of Auricularia by inactivated protoplast fusion[J].Edible Fungi of China，2003，22（5）：16-18.（in Chinese）