大蒜抑菌成分提取工藝優化

李艷梅， 趙福順

（內蒙古農業大學 職業技術學院，內蒙古 包頭014109）

大蒜（Allium sativum L）為百合科蔥屬多年生草本縮根植物，俗稱葫、獨蒜、葫蒜等，鱗莖俗稱“大蒜”[1-2]。大蒜的化學成分齊全，含有水、維生素、無機鹽、蛋白質、氨基酸、脂質類、糖類、微量元素及含硫化合物等，含硫化合物為大蒜的主要活性物質[3-7]。大蒜對真菌具有一定的抑制作用，其功能原理主要是含硫化合物成分與重要的巰基包含酶相互作用，使酶失去功用[8-12]。利用其抗菌原理，大蒜生物活性物質在臨床上被廣泛的應用。馬穆英等研究大蒜水溶液對幾十種常見真菌的抑制和殺菌作用，結果表明，根據測定的殺菌率，大蒜抗真菌的能力與化學防腐劑甲苯酸和山梨酸鉀的抗菌能力相當[13]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜，購于內蒙古包頭市農貿市場；番茄晚疫病菌，由內蒙古農業大學職業技術學院食品系提供；無水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，均購于天津市化學試劑三廠，分析純；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、馬鈴薯液體培養基（PDB），購于青島高科園海博生物技術有限公司。

RE-52AAA旋轉蒸發儀，上海嘉鵬科技有限公司制造；KG-SX-700型滅菌鍋，日本島津公司制造；VD-1320型無菌操作臺，哈爾濱東聯電子公司制造；MJX-150BX霉菌培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司制造。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將番茄晚疫病菌接種于滅菌后的PDA培養基上，26℃下培養72 h，活化3次，將第3代菌種采用血球板計數法，用滅菌后的生理鹽水稀釋成 1×107～1×109CFU/mL 的菌懸液。

1.2.3 抑菌實驗方法 采用牛津杯法[14]，配制PDA培養基，倒入滅菌培養皿中，冷卻凝固。將0.2 mL菌懸液接入培養基中，涂布均勻。將牛津杯放在培養基上，將0.2 mL待測液注入牛津杯中，以待測液的溶劑作為對照，平行3次，在26℃培養箱中培養72 h，測量抑菌圈的大小，照相。

1.2.4 抑菌物質提取工藝

1）提取溶劑的選擇：稱取各2.00 g大蒜粉末共10份，置于不同的三角瓶中，分別加入提取溶劑水、體積分數30%乙醇、體積分數50%乙醇、體積分數70%乙醇、體積分數90%乙醇、無水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇。料液比為 1∶5 （g/mL），在40℃提取2 h。然后按1.2.3進行抑菌實驗，并根據抑菌圈的大小確定最佳溶劑。

2）提取溫度的選擇：稱取各2.00 g大蒜粉末共6份，置于不同的三角瓶中，采用1）中選擇的最佳溶劑，料液比為 1∶5 （g/mL），提取時間為 2 h，提取2 次。 按 1.2.2 的提取工藝， 分別在 25、30、40、45、50、55℃下提取。然后按1.2.3進行抑菌實驗，并根據抑菌圈的大小確定最佳溫度。

3）提取時間的選擇：稱取各2.00 g大蒜粗粉共6份，置于不同的三角瓶中，采用已確定的最佳溶劑和最佳溫度，料液比為1∶5（g/mL）。按1.2.2的提取工藝， 分別在 1、2、3、4、5 h的條件下超聲波輔助提取2次，然后按1.2.3進行抑菌實驗，并根據抑菌圈的大小確定最佳提取時間。

4）料液比的選擇：稱取各2.00 g大蒜粗粉共6份，置于不同的三角瓶中，采用之前確定的最佳條件，按 1.2.2 的提取工藝，分別在 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 （g/mL）的條件下超聲波輔助提取2次。按1.2.3進行抑菌實驗，并根據抑菌圈的大小確定最佳料液比。

5）浸提次數的選擇：稱取各2.00 g大蒜粗粉共4份，置于不同的三角瓶中，采用已確定的提取條件，按 1.2.2的提取工藝，分別提取 1、2、3、4次。 按1.2.3進行抑菌實驗，并根據抑菌圈的大小確定最佳提取次數。

6）正交實驗：影響提取效率的因素是提取溫度（A）、提取時間（B）、提取料液比（C）、浸提次數（D）。根據以上單因素的實驗結果，通過 L16（44）正交實驗，經比較各自的抑菌效果，確定大蒜抑菌成分的最佳提取條件。

1.2.5 最小抑菌質量濃度實驗和最小殺菌質量濃度實驗 采用二倍稀釋法，取具塞試管9支編號，分別加5 mL的PDB液體培養基。取0.8 g/mL的大蒜粗提液5 mL加到1號試管中混勻，從1號試管中取5 mL加到2號試管中，以此類推，加到8號試管為止，再將第8支試管棄去5 mL。即各試管中藥液 的 質 量 濃 度 分 別 為 400、200、100、50、25、12.5、6.3、3.2 mg/mL，以不加大蒜粗提液為空白對照，滅菌。將每支試管中加入0.2 mL菌懸液，26℃，150 r/min培養72 h。觀察試管是否渾濁，不渾濁記為“—”，渾濁記為“+”，以未渾濁的最小質量濃度作為最小抑菌質量濃度。從每支試管中取0.2 mL加到PDA培養基中，涂布均勻，培養72 h。無菌落生長記為“—”，有菌落生長記為“+”，以未長菌的最小質量濃度為最小殺菌質量濃度。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的優選

根據1）的實驗設計進行了最佳提取溶劑的選擇實驗，實驗結果見圖1，不同溶劑其提取效果表現差異很大。水、體積分數30%乙醇、體積分數50%乙醇、乙酸乙酯作為提取溶劑時，提取液的抑菌圈直徑均大于30 mm；體積分數70%乙醇、體積分數90%乙醇、無水乙醇提取液的抑菌圈直徑在20～30 mm；三氯甲烷、正丁醇提取液的抑菌圈直徑在10～20 mm；石油醚提取液的抑菌圈直徑小于10 mm。根據其溶質相似相溶的原理，其結構相似的物質才能易于混溶，其中體積分數30%乙醇提取液的抑菌圈直徑最大，因此選擇體積分數30%乙醇作為最適溶劑。

圖1 溶劑對大蒜粗提液抑菌效果的影響Fig.1 Effects of different solvents on antifungal substances

2.2 提取溫度的優選

用體積分數30%乙醇作為提取溶劑，根據2）的實驗設計進行了最佳提取溫度的選擇實驗，實驗結果見圖2。隨著溫度增高，其抑菌效果逐漸提高，以提取溫度在35℃時，提取物的抑菌效果最好。隨著提取溫度的不斷增高，抑菌效果降低，這可能是由于溫度過高，使大蒜中的抑菌活性成分被降解。所以選擇35℃作為最佳提取溫度。

2.3 提取時間的優選

用體積分數30%乙醇作為提取溶劑，提取溫度為35℃時，不同時間處理提取液的抑菌效果見圖3。隨著時間的延長，提取液的抑菌效果逐漸增高，當提取時間達到2～3 h時，抑菌效果最好；當提取時間4～5 h時，隨著時間的延長，提取液的抑菌效果迅速下降。所以，選擇3 h作為最佳提取時間。

圖2 提取溫度對大蒜粗提液抑菌效果的影響Fig.2 Effects of different temperature on antifungal substances

圖3 提取時間對大蒜粗提液抑菌效果的影響Fig.3 Effects of different time on antifungal substances

2.4 提取料液比的優選

用體積分數30%乙醇作為提取溶劑，提取溫度為35℃，提取時間為3 h，不同的料液比的提取液抑菌效果見圖 4。當料液比為 1∶5～1∶10 （g/mL）時，隨著提取溶劑的增加，提取液抑菌效果也逐漸增高；當料液比在 1∶10～1∶30 （g/mL）時，抑菌效果隨料液比的變化趨于穩定。提取溶劑的增加，使物料與溶劑的接觸面積增大，有效成分的浸出也隨之加快，抑菌活性增強[8]。所以，選擇 1∶10 （g/mL）作為最適宜的料液比。

2.5 提取次數

用體積分數30%乙醇作為提取溶劑，提取溫度為 35 ℃，提取時間為 3 h，料液比 1∶10 （g/mL）。提取次數與提取液抑菌效果的關系見圖5。當提取次數為1～2次時，隨著提取次數的增多，抑菌效果也逐漸增高。當提取次數為3～4次時，隨著提取次數的增加，提取液的抑菌效果逐漸趨于平緩，所以選擇3次作為最適宜的提取次數。

圖4 提取料液比對大蒜粗提液抑菌效果的影響Fig.4 Effects of different solid-liquid ratio on antifungal substances

圖5 提取次數對大蒜粗提液抑菌效果的影響Fig.5 Effects of different times on antifungal substances

2.6 正交實驗

采用正交設計，確定了提取條件的最優組合，結果見表1。各因素對番茄晚疫病菌抑菌效果影響的主次關系為 D＞A＞C＞B。可以看出，A、B、C、D 4個因素的影響都具有統計學意義，D因素影響顯著，A因素影響僅次于D，即因素D對番茄晚疫病菌的抑菌效果起決定性的作用；因素C和因素B對抑菌效果的影響不如A和D。因此，綜合考慮各因素對番茄晚疫病菌的影響結果，確定了最佳配方組合為A3B1C3D3，即提取溫度 40 ℃，料液比 1∶5 （g/mL），提取時間3 h，提取3次。

2.7 最小抑菌質量濃度與最小殺菌質量濃度實驗

在上述實驗結果的基礎上，進行最小抑菌質量濃度與最小殺菌質量濃度的實驗。由表2可以看出，當藥液質量濃度在15.7 mg/mL時5號試管未渾濁，當藥液質量濃度達到6.3 mg/mL時6號試管出現渾濁現象。然后進行最小殺菌質量濃度實驗，當藥液質量濃度在12.5 mg/mL時有少量菌落。則表明大蒜粗提液對番茄晚疫病菌的最小抑菌質量濃度為12.5 mg/mL，最小殺菌質量濃度為25 mg/mL。

表1 L16（44）正交實驗結果Table 1 Result of orthogonal test L16（44）

表2 大蒜粗提液的最小抑菌濃度與最小殺菌濃度實驗結果Table 2 Result of MIC and MFC of antifungal substance

3 結語

通過對大蒜抗番茄晚疫病菌有效成分提取條件的研究，結果表明：大蒜提取液以體積分數30%乙醇作為提取溶劑，在40℃超聲波輔助提取3 h，提取次數為3次，料液比為1∶5（g/mL），即得到大蒜提取液的抑菌效果最佳的提取條件。在此條件下大蒜提取液對番茄晚疫病菌的抑菌直徑達到37.2 mm。大蒜提取液對番茄晚疫病菌最小抑菌質量濃度為12.5 mg/mL，最小殺菌質量濃度為25 mg/mL。由此可知，大蒜提取液的抑菌活性成分對番茄晚疫病菌有較強的抑制作用，科研成果為大蒜抑菌的深入研究與大蒜抑菌活性成分的開發利用提供了良好基礎。

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