非釀酒酵母菌在自然發酵過程中產脂肪酶特性

徐亞男， 李 琦， 肖 婧， 倪永清， 單春會， 史學偉

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子832000）

非釀酒酵母是一類自然存在于葡萄酒發酵過程中的微生物，其代謝物對酒的香氣、風味等感官特征有很重要的影響[1]。釀酒酵母和非釀酒酵母都參與酒精發酵過程，其中非釀酒酵母的脂肪酶產量高于釀酒酵母[2]，通常都是在發酵初期存在。脂肪酶是重要的工業酶制劑品種之一[3]，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應用于油脂加工、食品、醫藥、日化等工業。不同來源的脂肪酶具有不同的催化特點和催化活力。脂肪酶可以降解來自葡萄和酵母菌自溶的脂質，釋放脂肪酸來改善葡萄酒的品質[4]。葡萄酒生產中常用的脂肪酶多是來源于細菌或者絲狀真菌，但是其通常是不確定的復雜的酶的混合物，對葡萄酒可能存在某些不利影響。脂肪酶是一種特殊的酯鍵水解酶[5]，它可作用于甘油三酯的酯鍵，使甘油三酯降解為甘油二酯、單甘油酯、甘油和脂肪酸。目前國內外對野生微生物脂肪酶的研究與開發較為活躍。脂肪酶可以應用于生產生活的各個方面[6]，尤其在新疆葡萄酒的生產中有著廣泛的應用，脂肪酶作用后釋放出的鏈較短的脂肪酸，增加和改進食品的風味和香味，可以增進葡萄酒的香氣成分，改善酒的品質，因此對脂肪酶的特性的研究十分必要。

作者通過對非釀酒酵母中高產脂肪酶菌株的篩選、酶活測定，最終得到高產脂肪酶菌株Y13。此研究為提高果酒品質奠定了基礎，并對豐富釀造果酒菌種資源及擴大果酒市場占有率具有重要的推動作用。因此研究非釀酒酵母菌在新疆葡萄自然發酵過程中產脂肪酶特性亦十分有必要。

1 試驗材料

1.1 菌種及試劑

實驗室保藏的24株酵母菌株，其生長發育樹見圖1。

本試驗所使用化學試劑均為色譜純及分析純，由天津市巴斯夫化學試劑廠生產。

圖1 系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree

1.2 培養基

1.2.1 YPD培養基 葡萄糖2.0 g/dL，蛋白胨2.0 g/dL，酵母浸粉1.0 g/dL；蒸餾水配制，自然pH值，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 初篩培養基1 蛋白胨1.0 g/dL，酵母粉0.5 g/dL，NaCl 0.5 g/dL，CaCl20.01 g/dL，Tween80 1.0 g/dL，瓊脂 1.5 g/dL；pH 7.2。

1.2.3 初篩培養基2 蛋白胨1.0 g/dL，葡萄糖0.5 g/dL，硝 酸 銨 0.1 g/dL，MgSO4·7H2O 0.05 g/dL，NaCl 0.05 g/dL，K2HPO40.1 g/dL，瓊脂 2 g/dL，橄欖油乳化液1.2 g/dL，羅丹明B 0.1 g/dL。

1.2.4 種子培養液 葡萄糖10 g/dL，蛋白胨5 g/dL，K2HPO41.0 g/dL，MgSO40.5 g/dL；pH 7.2。

1.2.5 發酵培養基 葡萄糖10 g/dL，牛肉浸膏10 g/dL，K2HPO42.0 g/dL，MgSO40.3 g/dL，橄欖油乳化液10 g/dL；pH 7.5。 詳見文獻[7]。

2 試驗方法

2.1 菌株活化及擴增培養

2.1.1 菌株活化 將 4℃保藏的釀酒酵母菌株，分別接種于YPD液體管培養基中，在30℃下培養48 h活化。

2.1.2 擴增培養 將活化的菌株按體積分數5%的接種量接于已裝有100 mL YPD培養基的三角瓶中，于28℃、180 r/min搖床擴增培養72 h。

2.2 菌株產酶鑒定

酵母菌接種于初篩培養基1平板上，37℃培養4 d。脂肪酶能分解Tween80在菌落周圍形成的白色透明圈。

酵母菌接種于初篩培養基2平板上，37℃培養4 d。產脂肪酶的菌株會出現橘黃色熒光圈，挑選熒光圈大的進行復篩。

2.3 發酵條件優化

對篩選出的菌株進行產脂肪酶學特性研究，利用酶學特性優化發酵培養條件。

2.4 脂肪酶粗酶液的提取及酶活測定

挑取菌種接入裝有50 mL種子培養液的250 mL的三角瓶中培養48 h。種子培養液按體積分數5%接種量接種于裝有50 mL發酵培養基的250 mL的三角瓶中培養。收集發酵液，4℃下10 000 r/min離心10 min，獲得上清液作為粗酶液。

在試驗溫度和試驗pH下，每分鐘釋放1 μmol脂肪酸的酶量定義為一個酶活力單位 （μmol/（min·mL）），以U表示 。用NaOH滴定法進行酶活測定[8]。

2.5 脂肪酶酶學特性研究方法

分別選取測定溫度、pH、金屬離子、培養時間對酶活的影響為單因子，進行單因素試驗，計算公式如下：

式（1）中：V 為滴定樣液消耗的 NaOH 體積（mL），V0為滴定空白樣消耗的NaOH體積 （mL），t為反應時間（min），n 為酶液體積（mL），M 為滴定用的 NaOH溶液的濃度（mol/mL）。

3 結果與分析

3.1 產脂肪酶菌株鑒定

經試驗，通過肉眼觀察和紫外燈照射觀察發現，Y9、Y13、Y19、Y21 透明圈和熒光圈比較明顯，可以判定 Y9、Y13、Y19、Y21這 4株菌株可以產生脂肪酶，結果見圖2。

圖2 Y9、Y13、Y19、Y21透明圈和熒光圈比較結果Fig.2 Compare the results transparent and fluorescent ring of Y9、Y13、Y19、Y21

透明圈直徑越大酶活越高[9]。由表1根據透明圈的直徑大小的比較可得，透明圈的直徑大小Y19＜Y21＜Y9＜Y13，因此 Y13 酶活最高。

表1 鑒定結果Table 1 Authentication

3.2 脂肪酶酶學特性

3.2.1 溫度對酶活的影響 將酶液分別在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃中保溫 30 min，在35℃下測定其酶活力（其他條件為標準發酵條件）。結果見圖3。

由圖3可知，0～40℃脂肪酶的酶活一直在升高，脂肪酶保持較高的穩定性，在40℃以上時，脂肪酶的酶活迅速下降，這是因為40℃以上酶已變性失活。因此脂肪酶在40℃左右最為穩定。

圖3 溫度對酶活的影響Fig.3 Influence of temperature on enzyme activity

3.2.2 pH對酶活的影響 在酶活液中分別加入pH為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的緩沖液，在35℃下測定酶活力（其他條件為標準發酵條件）。結果見圖4。

圖4 pH對酶活的影響Fig.4 Effect of PH on enzyme activity

由圖4可知，在pH為5.0～7.5范圍內，酶活力一直升高，pH超過7.5，酶活力下降。脂肪酶在pH 7.0～7.5范圍內穩定性好，顯示較高活性，可見該脂肪酶為中性脂肪酶[10]。

3.2.3 金屬離子對酶活的影響 將Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Na+、K+、Zn2+、Mg2+分別加入到酶液中， 在 35 ℃下測定酶活（其他條件為標準發酵條件）。結果見圖5。

圖5 金屬離子對酶活的影響Fig.5 Effect of metal ion on enzyme activity

由圖5可知，不同的金屬離子對酶活的影響不同。Fe2+、Cu2+、Ca2+對酶有明顯的激活作用；Mn2+、Na+、K+、Zn2+對酶有微弱的激活作用；而Mg2+對酶具有一定的抑制作用。其中，Ca2+對酶的激活作用最顯著。

3.2.4 培養時間對酶活的影響 將酶液分別培養24、36、48、60、72、84 h，35 ℃下測定酶活（其他條件為標準發酵條件），結果見圖6。

圖6 培養時間對酶活的影響Fig.6 Effect of culture time on enzyme activity

由圖6可知，培養時間在36～60 h產酶能力隨培養時間的增加而增加，自60 h開始減少，產酶能力最大培養時間在60 h左右。

3.3 發酵條件的優化

通過單因素實驗得出：產酶的最適溫度為40℃，最適 pH 為 7.0～7.5，Fe2+、Cu2+、Ca2+對酶有明顯的激活作用，Ca2+作用最明顯，最適培養時間為60 h。

根據單因素試驗，選取影響力較大的4個因素進行正交試驗，結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

比較本實驗中的4個因素中Rj的大小，可以看出影響因素A＞C＞D＞B。優化組合為A1B2C3D3。即高產脂肪酶菌株最優培養條件為：培養溫度39℃，pH為7.0，培養時間為65 h，添加適量Ca2+。

4 結語

通過產脂肪酶試驗，根據透明圈和熒光圈的有無，以及透明圈直徑的大小，確定Y13是脂肪酶高產菌株。通過單因素試驗和正交試驗優化得酶的最適培養溫度為39℃，最適pH為7.0，Ca2+促進酶的發酵，最適培養時間為65 h，溫度是產酶試驗的最大影響因素。

脂肪酶可以應用于食品工業的各個方面，例如用于有機相合成的具有轉酯化或酯化功能的脂肪酶的規模化生產，對于酶催化合成精細化學品和手性化合物有重要意義。食品工業利用酶作用后釋放出的鏈較短的脂肪酸，增加和改進食品的風味和香味；利用脂肪酶催化的醇解和酯化反應來生產各種香精酯，作調料劑；用有1，3-專一性的微生物脂肪酶提高食用油營養價值和增加食用油的花色品種[11]，制備代可可酯等高檔油脂；另外，脂肪酶還可以用于酒類的去濁除渣，改善面包品質，改善蛋白質的發泡等方面。因此產脂肪酶菌株不僅可以應用于葡萄酒的生產、改善酒的香氣成分、提高葡萄酒的品質，而且還可以廣泛應用于其他食品工業，增加食品風味，提高食品的品質。

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